Infekcije urinarnega trakta so najpogostejše bakterijske okužbe in predstavljajo vse večjo obremenitev svetovnih zdravstvenih sistemov. Urogenitalne okužbe nastanejo zaradi vdora mikroogranizmov, največkrat iz področja prebavnega traku, v sečila, kjer se razmnožijo in povzročijo vnetje. Pri osebah s stalno vstavljenim uriskim katetrom so urogenitalne okužbe neizogibne. To so najpogosteje starejše osebe ali bolniki na oddelkih intenzivne nege, ki imajo zaradi nezmožnosti nadzorovanja iztekanja urina dolgotrajno vstavljen urninski kateter.Uropatogeni so v večini gram-negativne bakterije, najbolj značilna je E. coli. Najbolj pogost vzrok za okužbo urinarnega trakta pri bolnikih s trajnim urinskim katetrom je oportunistična gram negativna bakterija Proteus mirabilis. Je fakultativni anaerob paličaste oblike, ki ga uvrščamo v družino Enetrobacteriaceae.Patogenost P. mirabilis-a povečajo številni virulenčni faktorji, zlasti invazivnost baketerije,sposobnost kolonizacije novega okolja, sposobnost premikanja in obstanka, ter tvorba kristaličnega biofilma, ki je povezana z aktivnostjo encima ureaze. P. mirabilis značilno
kolonizira in tvori kristalični biofilm na grobi površini katetra, kar vodi do njegove blokade ter prispeva k dolgotrajnosti in obstojnosti okužbe.
Namen magistrske naloge je predstaviti nove vidike patogenosti bakterije P. mirabilis med urogenitalno okužbo pri bolnikih s trajno vstavljenim urinskim katetrom. Zaradi pogostosti in klinične pomembnosti teh okužb je iskanje potencialnih novih terapevtskih tarč izrednega pomena. Želimo izboljšati znanje o pomembnosti genetskih dejavnikov za izbrane gene, ki so vključeni v proces kolonizacije in nastanka biofilma. V predhodni študiji prof. A. Reisnerja, so s pomočjo uporabe metode ciljane mutagenze (»signature-tagged mutagenesis«, STM) ustvarili približno 1800 P. mirabilis mutant. Skupno je bilo ugotovljeno, da je rast 19 od vseh ustvarjenih mutant v modelu urinskega katetra in vitro (»CAUTI model«) signifikantno slabša v primerjavi z divjim tipom. Te mutante so imele mutacije za gene ompR, cpxA, arcA in arcB in so nakazovale možno vlogo teh dvokomponentnih transdukcijisko regulatornih sistemov v patogenezi P. mirabilis. Za potrditev pomembnosti teh genov in njihove vključenosti v proces kolonizacije in nastanka biofilma v pogojih in vitro smo najprej oblikovali mutante s pomočjo sistema
TargeTron® za natančno izbitje gena. Kljub večkratnim ponovitvam smo bili uspešni samo pri izbitju gena arcB. Pridobljeno mutanto smo
označili s HI4320arcB in jo v nadaljevanju fenotipsko ovrednotili na in vitro modelu mehurja z vstavljenim urinskim katetrom. Uporabljeni in vitro model je nadgradnja modela, ki ga je razvil David Stickler, zagotavlja konstantne fizikalno kemijske pogoje in posnema okoljske značilnosti v človeškem mehurju med urogenitalno okužbo pri bolnikih s trajno vstavljenim urinskim katetrom. Med individualnim testom rastnih značilnosti smo ugotovili, da se hitrost rasti med divjim tipom in HI4320arcB mutanto ne razlikuje. S tem testom smo pokazali, da izbitje gena ne vpliva na reprodukcijsko sposobnost in hitrost rasti mutante, kadar se rastne zančilnosti določajo individualno. Pri določanju rastnih značilnosti pri sočasnem testiranju v modelu urinskega katetra in vitro smo pokazali, da se po enako-številčnem začetnem vnosu (razmerje med divjim tipom in testirano mutanto je 1:1) njuno razmerje po 24 urni inkubaciji spremeni v prid divjemu tipu, in sicer na 8,5:1 v vsebini mehurja in na 4,5:1 na površini vstavljenega katetra. Rezultati torej kažejo, da je divji tip, v primerjavi s testirano mutanto, izkazoval večjo zmožnost razmnoževanja in rasti v mehurju (razmerje 0,12) in na površini katetra (razmerje 0,15). Dodatno smo določili tudi indeks kompeticije (CI) za kateter 0,16 in
vsebino mehurja 0,12 kar dokazuje, da je naša mutanta sposobna preživeti v in vitro pogojih. Podani rezultati nakazujejo, da je bila rast, vrednotena kot številčnost kolonij (»CFU«), testirane HI4320arcB mutante slabša v primerjavi z divjim tipom, kar smo potrdili tudi z
Wilcoxonovim statističnim testom. Začetna porazdelitev divjega tipa in testiraneHI4320arcB mutante v pred-kulturi ni bila različna (P>0.05, p= 0.686), medtem ko smo v mehurju in na katetru 24 ur po infekciji dokazali, da je divji tip v rasti signifikantno premagal HI4320arcB mutanto (P<0.05). Rezultati nakazujejo, da je rast, vztrajanje, invazivnost in večja zmošnost kolonizacije signifikantno boljša za divji tip P. mirabilis HI4320. Na podlagi tega, lahko predpostavimo, da vloga gena arcB ni pomembna pri kolonizaciji mehurja in katetra med okužbo urinarnega trakta s P. mirabilis pri bolnikih s trajno vstavljenim urinskim katetrom. V nadaljevanju smo s spomočjo RT-qPCR analizirali relativno gensko ekspresijo genov ompR, cpxA, arcA in arcB v divjem tipu z uporabo metode ΔΔCt. Primerjali smo relativno gensko ekspresijo v umetnem in pravem urinu. V ta namen smo izolirali RNA iz predkulture, vsebine mehurja in površine katetra. Nato smo RNA prepisali v cDNA in jo ovrednotili z RT-qPCR. Primerjali smo dva kompleta za prepis RNA v cDNA, SuperScript®II Reverse transcriptase komplet in DyNAmoTM cDNA Syntheisis (470L) komplet, in ugotovili, da sta enako uspešna pri prepisu RNA v cDNA ter da so pridobljeni rezultati primerjljivi. Na podlagi primerljivih rezultatov smo se odločili, da izberemo DyNAmoTM cDNA Syntheisis (470L) komplet, saj je finančno ugodnejši. Rezultati določanja učinkovitost RT-qPCR so pokazali, močen linearni odnos med Ct vrednostjo in log koncentracije cDNA. Dobra specifičnost pomnoževanja za vsako posamezno kombinacijo nukleotidnih začetnikov je bila določena na podlagi pregleda vrha talilne krivulje. Pri ovrednotenju genske ekspresije, zaradi majhnega števila vzorcev, rezultatov ni bilo mogoče statistično ovrednotiti, zato smo opisali le glavne trende. Ugotovili smo, da je bilo izražanje gena arcA in arcB večje v mehurju in na katetru, kar bi lahko nakazovalo, da je aktivacija sistema ArcAB pomembna predvsem, kadar se P. mirabilis nahaja v okolju z omejeno količino kisika. Rezultati so pokazali tudi, da je vloga cpxA verjetno manj pomembna pri procesu kolonizacije in da se gen ompR različno izraža v mehurju in na katetru. V zadnjem delu eksperimentalnega dela smo ovrednotili vlogo genov arcB in arcA v anaerobnih pogojih ter genov cpxA in ompR v okoljih z zvišano omsolarnostjo. V ta namen smo testirali HI4320arcB mutanto ter transponske mutante P12H3 (arcA), P17-E5 (cpxA), P70C10 (ompR) v rastnih mediji, ki so vsebovali višje koncentracije ureje, NaCl in H2O2. Ugotovili smo, da sta bili mutanti P12H3 in HI4320arcB enako dovzetni do dodatka H2O2 kot divji tip ter da višja slanost in osmotski stres različno vplivata na rast mutante P17-E5 in P70C10 kot na divji tip. Z našimi ugotovitvami smo postavili osnovo za nadaljne raziskovanje dvokomponentnih transdukcijisko regulalatornih sistemov genov ompR, cpxA, arcA in arcB pri P. mirabilis. Boljše razumevanje genetskih faktorjev, molekularnih mehanizmov in dvokomponentnih regulatornih sistemov vodi v razvoj potencialnih molekulskih tarč za razvoj zdravil in cepiv ter učinkovitih terapevtskih strategij za nadzor in preprečevanje okužb urinarnega
trakta pri bolnikih s trajno vstavljenim urinskim katetrom.
|
