Sinteza in vrednotenje nove fluorescenčne sonde za test fluorescenčne polarizacije za rešetanje zaviralcev galektina-8

Kojek, Zala (avtor), Anderluh, Marko (mentor), Purić, Edvin (komentor)

Galektin-8 je zaradi vpletenosti v različne patofiziološke procese, vključno z razvojem raka, zanimiva tarča za razvoj novih zdravilnih učinkovin. Osrednji cilj magistrske naloge je bila sinteza fluorescenčne sonde za razvoj kompetitivnega testa fluorescenčne polarizacije, namenjenega iskanju selektivnih zaviralcev galektina-8 z rešetanjem visoke zmogljivosti. Z reakcijo klik kemije, natančneje z bakrom(I) katalizirano azid-alkin cikloadicijo, sta bili pripravljeni dve novi fluorescenčni sondi. Obe sta vsebovali enak del, ki se veže na galektin-8, razlikovali pa sta se v fluoroforu: ena je vsebovala BODIPY, druga pa fluorescein. Spektroskopsko vrednotenje fotofizikalnih lastnosti obeh sond je obsegalo preučevanje ekscitacijskih in emisijskih spektrov ter določitev odvisnosti intenzitete fluorescence od koncentracije sonde. Z neposrednim testom fluorescenčne polarizacije smo ovrednotili afiniteto obeh sond do galektina-8. Test temelji na merjenju polarizacije fluorescenčne svetlobe, ki jo sonda odda po vzbujanju. Stopnja polarizacije je odvisna od hitrosti vrtenja fluorescenčne sonde, ta pa je povezana z njeno velikostjo. Prosta sonda se v raztopini hitro vrti, zato se oddana svetloba v večji meri depolarizira. Po vezavi na galektin se sonda vrti počasneje, zaradi česar se polarizacija poveča. S spremljanjem povečevanja fluorescenčne polarizacije v odvisnosti od koncentracije galektina lahko določimo afiniteto vezave sonde. Za preučevanje selektivnosti smo ovrednotili vezavo obeh sond tudi na sorodna galektin-3 in galektin-1. Obe sondi sta izkazali primerljivo visoko afiniteto do tarčnega galektina-8. Fluoresceinska sonda je izkazala nižjo afiniteto do galektina-1 in galektina-3, medtem ko so bili rezultati meritev z BODIPY sondo manj zanesljivi. S kompetitivnim testom fluorescenčne polarizacije s tremi znanimi zaviralci galektina-8 smo preverili primernost fluoresceinske sonde za uporabo pri rešetanju visoke zmogljivosti. Vsi trije zaviralci so koncentracijsko odvisno izpodrivali sondo iz kompleksa z galektinom-8. Določene afinitete zaviralcev so bile primerljive z objavljenimi vrednostmi, pridobljenimi s tetrasaharidno fluorescenčno sondo. Izračunane vrednosti faktorjev Z in Z′ so podprle primernost kompetitivnega testa za rešetanje visoke zmogljivosti.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: galektin-8, zaviralci galektina-8, fluorescenčna sonda, test fluorescenčne polarizacije, rešetanje visoke zmogljivosti
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Založnik: [Z. Kojek]
• Leto izida: 2026
• PID: 20.500.12556/RUL-189695
• UDK: 615.4:54
• COBISS.SI-ID: 300977155
• Datum objave v RUL: 13.10.2026

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Synthesis and evaluation of a novel fluorescent probe for a fluorescence polarization assay for screening galectin-8 inhibitors

Izvleček

Galectin-8 is involved in several pathophysiological processes, including cancer development, and is therefore an attractive target for the discovery of new therapeutic agents. The main aim of this master’s thesis was to synthesise a fluorescent probe for the development of a competitive fluorescence polarisation assay designed to identify selective galectin-8 inhibitors through high-throughput screening. Two new fluorescent probes were prepared using click chemistry, specifically copper(I)-catalysed azide–alkyne cycloaddition. Both probes contained the same galectin-8-binding moiety but differed in their fluorophore: one contained BODIPY and the other fluorescein. The spectroscopic evaluation of their photophysical properties included the examination of excitation and emission spectra and the relationship between fluorescence intensity and probe concentration. The binding affinity of both probes for galectin-8 was evaluated using a direct fluorescence polarisation assay. The assay measures the polarisation of the fluorescent light emitted by the probe after excitation. The degree of polarisation depends on the rate of rotation of the fluorescent probe, which is related to its size. A free probe is small and rotates rapidly in solution, causing greater depolarisation of the emitted light. Upon binding to galectin, the probe rotates more slowly and the measured polarisation increases. Monitoring this increase at different galectin concentrations allows the binding affinity of the probe to be determined. To investigate binding selectivity, the binding of both probes to galectin-3 and galectin-1 was also evaluated. Both probes showed comparably high affinity for the target galectin-8. The fluorescein probe showed lower affinity for galectin-1 and galectin-3, whereas the results obtained with the BODIPY probe were less reliable. A competitive fluorescence polarisation assay using three known galectin-8 inhibitors was performed to assess the suitability of the fluorescein probe for high-throughput screening. All three inhibitors displaced the probe from its complex with galectin-8 in a concentration-dependent manner. The determined inhibitor affinities were comparable to published values obtained using a tetrasaccharide fluorescent probe. The calculated Z and Z′ factor values supported the suitability of the competitive assay for high-throughput screening.

• Ključne besede: galectin-8, galectin-8 inhibitors, fluorescent probe, fluorescence polarisation assay, high-throughput screening