Računalniška strukturna analiza iztočne črpalke AcrB iz Escherichia coli

Ravbar, Maja (avtor), Frlan, Rok (mentor)

Naraščajoča bakterijska odpornost vse bolj omejuje učinkovitost antibiotikov in predstavlja resen izziv sodobne medicine. Enega izmed pomembnih mehanizmov odpornosti predstavljajo iztočne črpalke. Te primarno vzdržujejo celično homeostazo z odstranjevanjem endogenih in okoljskih spojin, ob prekomernem izražanju pa lahko izrazito znižajo znotrajcelično koncentracijo antibiotikov. Klinično najbolj problematične so iztočne črpalke pri Gram negativnih bakterijah, zlasti črpalke iz družine RND, ki so zaradi svoje strukturne kompleksnosti in širokega substratnega spektra pomemben dejavnik pri razvoju večkratne odpornosti. V okviru magistrske naloge smo najprej izvedli pregled iztočnih črpalk, njihovih substratov in zaviralcev. Ugotovili smo, da je število znanih zaviralcev omejeno, raziskave pa so neenakomerno porazdeljene med posameznimi tarčami, pri čemer so klinično najpomembnejše večkratno odporne črpalke slabo zastopane. Med najbolj raziskanimi je AcrB iz Escherichia coli, za katero je v literaturi opisanih največ kristalnih struktur. V magistrski nalogi smo se osredotočili na njeno strukturno analizo z uporabo bioinformacijskih orodij. Z algoritmoma ProBiS in BLAST smo iskali podobne proteine in ugotovili, da je AcrB tako strukturno kot na podlagi aminokislinskega zaporedja najbolj podobna črpalki MexB iz Pseudomonas aeruginosa. Z uporabo strežnika ConSurf smo analizirali evolucijsko ohranjenost proteina, rezultate pa povezali z vezavnimi mesti, identificiranimi z vizualno analizo kristalnih struktur iz podatkovne zbirke PDB v programu PyMOL. Ugotovili smo, da se vezavna mesta za zaviralce in substrate v veliki meri prekrivajo, večina pa jih je slabše evolucijsko ohranjenih, kar je posledica prilagodljivosti črpalke na različne substrate. Kljub temu smo identificirali tudi posamezna evolucijsko zelo dobro ohranjena vezavna mesta, ki predstavljajo zanimive tarče. V sklepnem delu smo z orodjem SiteMap identificirali nova potencialna vezavna mesta in na podlagi njihove primernosti za vezavo majhnih molekul ter evolucijske ohranjenosti izbrali najobetavnejša za nadaljnje ciljanje. Na koncu lahko povzamemo, da smo v okviru magistrske naloge vzpostavili celovit in sistematičen okvir za identifikacijo ter vrednotenje potencialnih vezavnih mest na iztočni črpalki AcrB. Takšen pristop lahko uporabimo tudi pri preučevanju sorodnih RND transportnih sistemov pri drugih klinično pomembnih patogenih, kot je MexB pri Pseudomonas aeruginosa. S tem naloga pomembno prispeva k razvoju novih strategij za premagovanje naraščajoče odpornosti na antibiotike.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: AcrB, iztočne črpalke, zaviralci iztočnih črpalk, evolucijska ohranjenost, vezavna mesta
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Leto izida: 2026
• PID: 20.500.12556/RUL-180328
• Datum objave v RUL: 06.03.2026

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Computational structural analysis of the AcrB efflux pump from Escherichia coli

Izvleček

Rising bacterial resistance increasingly limits the effectiveness of antibiotics and represents a major challenge in modern medicine. One of the important mechanisms underlying resistance is the action of efflux pumps. These primarily maintain cellular homeostasis by exporting endogenous and environmental compounds; however, their overexpression can markedly reduce the intracellular concentration of antibiotics. Efflux pumps in Gram-negative bacteria are particularly problematic in clinical settings, especially those belonging to the RND family, which, due to their structural complexity and broad substrate spectrum, play a significant role in the development of multidrug resistance. In this master’s thesis, we first conducted a review of efflux pumps, their substrates, and known inhibitors. We found that the number of identified inhibitors is limited and that research efforts are unevenly distributed among individual targets, with clinically most relevant multidrug-resistant pumps being underrepresented. Among the most extensively studied is AcrB from Escherichia coli, for which the largest number of crystal structures has been reported. The thesis therefore focused on the structural analysis of AcrB using bioinformatic tools. Using the ProBiS and BLAST algorithms, we identified structurally and sequence-related proteins and found that AcrB is most similar, both structurally and at the amino acid sequence level, to the MexB pump from Pseudomonas aeruginosa. Evolutionary conservation was analyzed using the ConSurf server, and the results were correlated with binding sites identified by visual inspection of crystal structures from the PDB database using PyMOL. We observed substantial overlap between inhibitor and substrate binding sites, most of which are poorly conserved, reflecting the pump’s adaptability to diverse substrates. Nevertheless, several highly conserved binding sites were also identified,representing promising targets. In the final part of the study, novel potential binding sites were identified using the SiteMap tool, and the most promising sites for further targeting were selected based on their suitability for small-molecule binding and evolutionary conservation. In conclusion, this thesis establishes a comprehensive and systematic framework for the identification and evaluation of potential binding sites in the AcrB efflux pump. This approach can also be applied to related RND transport systems in other clinically important pathogens, such as MexB in Pseudomonas aeruginosa, thereby contributing to the development of new strategies to overcome the growing problem of antibiotic resistance.

• Ključne besede: AcrB, efflux pumps, efflux pump inhibitors, evolutionary conversation, binding sites