Optimizacija predpriprave vzorca bakterijskega lizata E. coli za analizo vsebnosti izooblik plazmidne DNA s kapilarno gelsko elektroforezo

Hreščak, Sara (avtor), Pajk, Stane (mentor), Miklavčič, Rok (komentor)

Plazmidna DNA (pDNA) ima pomembno vlogo v sodobni biotehnologiji, zlasti pri razvoju genske terapije ter cepiv z DNA in mRNA. Pridobivanje pDNA vključuje vse od načrtovanja plazmidnih vektorjev, gojenja bakterijske kulture, žetve biomase in lize celic, čiščenja pDNA, do vmesne in končne analitike. Po alkalni lizi bakterijskih celic se nečistote, kot so RNA, proteini, kromosomska DNA, iz vzorca najprej odstranijo z uporabo različnih kromatografskih in nekromatografskih tehnik s ciljem pridobiti produkt z visoko vsebnostjo dodatno zvite oblike (SC) pDNA. V končnem produktu se za natančno določitev posameznih konformacijskih oblik pDNA uporablja kapilarna gelska elektroforeza (CGE), kjer je za učinkovito elektrokinetsko injiciranje ključnega pomena nizka prevodnost analiziranega vzorca, za kar je potreben postopek razsoljevanja. Namen naloge je bila analiza kompleksnega biološkega vzorca – lizata E. coli – s CGE in v ta namen raziskati ter optimizirati metode njegove ustrezne predpriprave. Z eksperimentalnim delom smo potrdili, da je predpriprava vzorca pDNA bistvena za uspešno analizo. Za odstranjevanje soli iz lizata smo testirali različne centrifugalne filtre. Najboljše rezultate sta dosegla filtra z membrano iz regenerirane celuloze in izključitveno molekulsko maso (MWCO) 10 kDa, saj sta omogočila učinkovito odstranjevanje soli ob minimalnih izgubah RNA in pDNA. Ugotovili smo, da trije cikli centrifugiranja predstavljajo optimalno ravnovesje med časovno učinkovitostjo in doseženo občutljivostjo analize s CGE. Kot alternativo smo preizkusili tudi prototipno monolitno centrifugalno kolono, ki deluje na principu anionske izmenjevalne kromatografije. Nukleinske kisline iz lizata smo na kolono vezali v specifičnih pogojih in jih nato uspešno eluirali z raztopino 0,1-kratnega pufra tris-borat-EDTA, kar predstavlja pogoje, primerne za nadaljnjo analizo s CGE. Ta pristop je omogočil še učinkovitejše odstranjevanje soli kot s centrifugalnimi filtri, s krajšim časom obdelave in razmeroma nizkimi izgubami nukleinskih kislin, kar smo potrdili tudi z analizo s tekočinsko kromatografijo.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: plazmidna DNA, kapilarna gelska elektroforeza, predpriprava vzorca, centrifugalni filtri, monolitna centrifugalna kolona
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Leto izida: 2025
• PID: 20.500.12556/RUL-173518
• Datum objave v RUL: 18.09.2025

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Optimization of E. coli bacterial lysate preparation for the analysis of plasmid DNA isoform composition by capillary gel electrophoresis

Izvleček

Plasmid DNA (pDNA) plays an important role in modern biotechnology, particularly in the development of gene therapy and DNA or mRNA vaccines. The production of pDNA involves the design of plasmid vectors, their cultivation, purification, and both intermediate and final analysis. Following alkaline lysis of bacterial cells, impurities such as RNA, proteins, and chromosomal DNA are first removed using various chromatographic and nonchromatographic techniques, with the aim of obtaining a product with a high content of the supercoiled form (SC) of pDNA. In the final product, capillary gel electrophoresis (CGE) is used for precise determination of individual isoforms of pDNA, where low conductivity of the analysed sample is crucial for efficient electrokinetic injection. In this master’s thesis, we focused on CGE analysis of a complex biological sample – E. coli lysate – and for this purpose we investigated and optimised methods for its appropriate sample preparation. Experimental work confirmed that pDNA sample preparation is essential for successful CGE analysis. Centrifugal filters were tested for the removal of salts from the lysate. Filters with a regenerated cellulose membrane and 10 kDa MWCO gave the best results, as they enabled efficient salt removal with minimal loss of RNA and pDNA. We found that three centrifugation cycles represented the optimal balance between time efficiency and sensitivity achieved in CGE analysis. As an alternative, we tested a prototype monolithic spin column, based on the principle of anion-exchange chromatography. Nucleic acids from the lysate were bound to the column under specific conditions and then successfully eluted with 0.1x TBE buffer suitable for further CGE analysis. This approach allowed even more efficient salt removal than centrifugal filters, with shorter processing time and relatively low nucleic acid loss, which was also confirmed with liquid chromatography analysis.

• Ključne besede: plasmid DNA, capillary gel electrophoresis, sample preparation, centrifugal filters, monolithic spin column