Vloga P-telesc pri razgradnji mRNA uravnavani s proteinom Lin28A.

Starman, Maša (avtor), Modic, Miha (mentor)

Brezmembranski celični kondenzati, kot so P-telesca, predstavljajo pomemben mehanizem prostorske organizacije znotraj celice, ki omogoča natančno regulacijo izražanja genov na posttranskripcijski ravni, vendar njihova funkcionalna povezava s ključnimi regulatorji celične usode, kot je LIN28A, ostaja premalo raziskana. V magistrskem delu smo proučevali vlogo citoplazemskih procesitnih telesc pri LIN28A-posredovanem uravnavanju stabilnosti mRNA v mišjih zarodnih matičnih celicah. Ker smo želeli določiti interakcijske partnerje LIN28A, smo razvili in optimizirali protokol za ko-imunoprecipitacijo, ki je omogočil učinkovito izolacijo specifičnih interakcij. Ugotovili smo, da pufer z 0,1–1 % Tween 20 in fiziološko koncentracijo soli omogoča stabilno zajetje nativnih kompleksov z minimalnim nespecifičnim ozadjem, pri čemer ena ura inkubacije zadošča za zadosten izplen. Dodatno smo optimizirali postopno mehko elucijo z natrijevim citratom, ki ohranja proteinske komplekse v nativni obliki in je primerna za nadaljnjo proteomsko analizo. Z vključitvijo benzonaze smo pokazali, da večina interakcij ni RNA-odvisna; v nekaterih primerih je razgradnja RNA celo omogočila vezavo dodatnih proteinov, kar nakazuje na možen zaviralni vpliv RNA na dostopnost vezavnih mest. Z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 smo z izbrisom gena DDX6 onemogočili tvorbo P-telesc ter nato uvedli inducibilno izražanje proteina LIN28A-GFP. Kvantitativna imunofluorescenčna analiza je potrdila, da se LIN28A kopiči v P-telescih le, če so ta funkcionalno prisotna, kar kaže, da je za relokalizacijo ob diferenciacijskih signalih nujna njihova struktura. Nazadnje smo z imunodetekcijo pokazali, da so P-telesca potrebna za stabilizacijo SOX2, kar neposredno potrjuje, da P-telesca niso le mesta razgradnje RNA, temveč prostorsko organizirana regulatorna središča, nujna za zaščito in stabilizacijo mRNA s pomočjo LIN28A. Rezultati naše raziskave prvič eksperimentalno potrjujejo neposredno vlogo P-telesc pri stabilizaciji specifičnih molekul RNA prek delovanja LIN28A, kar predstavlja pomemben dokaz njihove funkcionalnosti v uravnavanju celične usode. To je ključen prispevek k razumevanju, kako celica prostorsko organizira posttranskripcijsko regulacijo, in hkrati odpira nove možnosti za razvoj terapevtskih pristopov, zlasti na področju regenerativne medicine, diferenciacije in bolezni, povezanih z motnjami v stabilnosti mRNA. Na tej osnovi bodo prihodnje raziskave lahko še natančneje opredelile mehanizme delovanja P-telesc in raziskale njihovo vlogo v različnih fizioloških in patoloških kontekstih.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: LIN28A, P-telesca, RNA-vezavni proteini, posttranskripcijska regulacija, koimunoprecipitacija, DDX6, mišje embrionalne matične celice
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
• Organizacija: BF - Biotehniška fakulteta
• Leto izida: 2025
• PID: 20.500.12556/RUL-170883
• COBISS.SI-ID: 243371523
• Datum objave v RUL: 20.07.2025

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: The role of P-bodies in LIN28A mediated mRNA decay.

Izvleček

Membraneless cellular condensates, such as P-bodies, represent an important mechanism of spatial organization within the cell, enabling precise regulation of gene expression at the post-transcriptional level. Despite increasing interest in their role, the functional connection between P-bodies and key regulators of cell fate, such as LIN28A, remains insufficiently explored. In this master’s thesis, we investigated the role of cytoplasmic membraneless condensates – P-bodies – in LIN28A-mediated regulation of mRNA stability in mouse embryonic stem cells. To identify interaction partners of LIN28A, we developed and optimized a co-immunoprecipitation protocol that enabled efficient isolation of specific interactions. We found that a buffer containing 0.1–1% Tween 20 and physiological salt concentration allows stable capture of native complexes with minimal nonspecific background, with one hour of incubation being sufficient for adequate yield. Furthermore, we optimized a stepwise gentle elution using sodium citrate, which preserves protein complexes in their native form and is suitable for downstream proteomic analysis. By including benzonase, we demonstrated that most interactions are not RNA-dependent; in some cases, RNA degradation even enabled the binding of additional proteins, suggesting a potential inhibitory effect of RNA on the accessibility of binding sites. Using CRISPR/Cas9 technology, we deleted the DDX6 gene to prevent the formation of P-bodies and introduced inducible expression of LIN28A-GFP. Quantitative immunofluorescence analysis confirmed that LIN28A accumulates in P-bodies only when they are functionally present, indicating that their structure is essential for relocalization upon differentiation signals. Finally, through immunodetection, we showed that P-bodies are required for the stabilization of SOX2, directly confirming that P-bodies are not merely sites of RNA degradation, but spatially organized regulatory hubs necessary for the protection and stabilization of mRNA through LIN28A. Our results provide the first experimental confirmation of a direct role for P-bodies in the stabilization of specific RNA molecules via LIN28A, representing a significant demonstration of their functionality in regulating cell fate. Our findings advance the understanding of spatial post-transcriptional regulation and open avenues for therapeutic development in regeneration, differentiation, and mRNA stability–related diseases, while future studies may further clarify P-body functions in diverse biological contexts.

• Ključne besede: LIN28A, P-bodies, RNA-binding proteins, post-transcriptional regulation, co-immunoprecipitation, DDX6, mouse embryonic stem cells