Sinteza in biološko vrednotenje himernih razgrajevalcev butirilholin esteraze z distančniki na osnovi piperidina

Kocjančič, Metka (avtor), Knez, Damijan (mentor), Pišlar, Anja (komentor)

V zadnjih letih pridobivajo pristopi ciljane razgradnje proteinov vse večjo pozornost kot alternativa klasičnim reverzibilnim in ireverzibilnim zaviralcem. Ključna razlika je v opustitvi tradicionalnega principa zasedenosti vezavnega mesta (angl. occupancy-driven) v prid farmakološkega modela dogodka (angl. event-driven). Ta model omogoča proteolitično razgradnjo tarčnega proteina, pri čemer ligandi delujejo katalitsko, kar omogoča doseganje želenih farmakoloških učinkov že pri zelo nizkih koncentracijah. Trenutno najbolj raziskana in razvita tehnologija ciljane razgradnje proteinov je uporaba molekule PROTAC (angl. proteolysis-targeting chimera), pri čemer je bil njihov razvoj do sedaj usmerjen predvsem v zdravljenje rakavih bolezni. V magistrski nalogi smo pristop razširili na nekoliko manj raziskano področje tarčne razgradnje proteinov – na nevrodegenerativne bolezni, s poudarkom na Alzheimerjevi bolezni (AB). Po holinergični hipotezi je upad kognitivnih funkcij pri AB odraz propada holinergičnih nevronov v centralnem živčnem sistemu, kar poudarja pomembno vlogo butirilholin esteraze (BChE), serinske hidrolaze, ki razgradi živčni prenašalec acetilholin, pri napredovanju te bolezni. Sintetizirali smo 11 molekul PROTAC, ki preko različnih distančnikov na osnovi piperidina povezujejo ligand za tarčni protein – BChE ter ligand za ligazo E3 cereblon. Sinteza je potekala v več stopnjah, pri čemer smo istovetnost produktov potrdili z masno spektrometrijo in jedrno magnetno resonanco. Biološka testiranja molekul PROTAC so vključevala določitev zaviralne aktivnosti na BChE in sorodni acetilholin esterazi ter oceno njihove sposobnosti razgradnje BChE v celicah SH-SY5Y s prenosom Western. Pri koncentraciji 0,1 µM smo pri večini ovrednotenih spojin že po 6 h opazili zmanjšano izražanje BChE, ki pa se je po 24 h povrnilo na prvotno raven. Pri 10-krat višji koncentraciji spojine, 1 µM, pa je bil učinek obrnjen – v prvih 6 h razgradnje BChE ni bilo zaznati, medtem ko je po 24 h izražanje BChE padlo tudi za 30 % vrednosti kontrole. Kljub temu da so vse spojine izkazovale zaviralno aktivnost na hBChE v nanomolarnem območju, le-ta ni zadosten pogoj za uspešno razgradnjo tarčnega encima. V nadaljevanju bi bilo potrebno potrditi tako časovno odvisnost razgradnje BChE pri več časovnih točkah, kot tudi koncentracijsko odvisnost razgradnje, kar bi dalo bolj jasen odgovor o primernosti pripravljenih himernih molekul PROTAC za nadaljnji razvoj.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: molekule PROTAC, Alzheimerjeva bolezen, butirilholin esteraza, distančnik, nevrodegenerativne bolezni
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Leto izida: 2025
• PID: 20.500.12556/RUL-168470
• Datum objave v RUL: 15.04.2025

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Synthesis and biological evaluation of butyrylcholinesterase proteolysis-targeting chimeras with piperidine-based linkers

Izvleček

In recent years, targeted protein degradation (TPD) techniques have gained increasing attention as an alternative to classical reversible and irreversible inhibitors. The key distinction lies in abandoning the traditional occupancy-driven model in favor of the event-driven pharmacological paradigm. This approach allows proteolytic degradation of target proteins, with the ligands acting catalytically, thereby achieving the desired pharmacological effects at very low concentrations. The most intensively investigated and developed TPD technology to date is PROTAC molecules (PROTACs), primarily explored for cancer treatment. In this master's thesis we have extended this approach to a less explored area of TPD – neurodegenerative diseases, with a focus on Alzheimer’s disease (AD). According to the cholinergic hypothesis, the cognitive decline in AD is due to the degeneration of cholinergic neurons in the central nervous system, highlighting the crucial role of butyrylcholinesterase (BChE), a serine hydrolase that breaks down the neurotransmitter acetylcholine, in the disease progression. We synthesized 11 PROTACs that link a BChE-targeting ligand and a E3 ligase cereblon ligand through various piperidine-based linkers. The synthetic pathway involved multiple step, with the identity of compounds being confirmed by mass spectrometry and NMR spectroscopy. The biological evaluation of PROTACSs included determining their inhibitory potencies against BChE and related acetylcholinesterase, as well as assessing their ability to induce proteolytic degradation of BChE in SH-SY5Y cells using Western blot transfer. At 0.1 µM, almost all PROTACs reduced BChE expression within 6 hours. In majority of cases, the enzyme levels recovered after 24 hours. At a 10-fold concentration, 1 µM, the effect was reversed – no BChE degradation was observed within the first 6 hours, while after 24 hours, BChE expression decreased for 30% compared to control experiment. Although all compounds inhibited BChE in the nanomolar range, the inhibitory potency itself is not sufficient for successful degradation of the target enzyme. In the follow up studies, it would be necessary to confirm both the time dependence of BChE degradation at several time points, as well as the concentration dependence of degradation, which would give a clearer answer about the suitability of the prepared chimeric PROTACs for further development.

• Ključne besede: PROTACs, Alzheimer's disease, butyrylcholinesterase, linker, neurodegenerative disorders