Naša raziskava se je osredotočala na razvoj in inženiring sevov kvasovke Y. lipolytica. Za cilj smo si zadali ovrednotenje vpliva modifikacij centralnega metabolizma, ki vodijo do sinteze citosolnega acetil-CoA, na kvasovko Y. lipolytica, ki bo zmožna proizvodnje izbranega terpenoida. Najprej smo se želeli v kvasovki Y. lipolytica vzpostaviti proizvodnjo karnozolne kisline, vendar smo bili pri temu neuspešni. Analize genskega izražanja so pokazale, da nam ni uspelo uspešno izraziti gena ATR1, ki je potreben za pravilno funkcioniranje citokrom P450 monooksigenaz, ki sodelujejo v biosintezni poti karnozolne kisline. Po drugi strani smo uspešno pripravili set starševskih sevov z različnimi kapacitetami za proizvodnjo beta-karotena, ki smo jih nato uporabili v drugem delu naše naloge za poglobljeno ovrednotenje metabolnih obvodov. Za drugi del naše naloge smo pripravili dve genski kaseti z geni povezanimi s piruvatnim obvodom, eno z geni fosfoketolaznega obvoda in tri z geni za prenos acetil-CoA s karnitinom. Vse genske kasete smo integrirali v starševske seve in jih podvrgli seriji gojitvenih eksperimentov. Odkrili smo, da je večina metabolnih obvodov negativno vplivala na sposobnost proizvodnje beta-karotena. Ko pa smo pogledali proizvodnjo lipidov, smo odkrili pozitiven trend – večina modifikacij, ki je negativno vplivala na produkcijo beta-karotena, je pozitivno vplivala na sposobnost transgenih kvasovk na kopičenje lipidov. Najvišjo vsebnost lipidov, 0.61 ± 0.04 glipidi/gDCW smo izmerili pri sevih, ki so vsebovali prekomerno izražen gen karnitinskega obvoda YlCAT2. Najvišjo zvišanje učinkovitosti pri proizvodnji lipidov pa smo izmerili pri sevu, ki je vseboval prekomerno izražene gene piruvatnega obvoda (YlPDC1, YlALD3 in YlACS1). Obraten povezava med vplivom na proizvodnjo lipidov in beta-karotena še ni bila pokazana in namiguje na regulacijo aktivnosti biosinteze lipidov in mevalonatne poti ob povišani prisotnosti acetil-CoA.
|
