Optimizacija postopka za pripravo človeških monoklonskih protiteles iz periferne krvi imuniziranih darovalcev na modelu hepatitisa B

Omejec, Sandra (avtor), Čurin Šerbec, Vladka (mentor)

Rekombinantna človeška monoklonska protitelesa zaradi svojih lastnosti predstavljajo pomembno skupino bioloških zdravil. V zadnjih dveh desetletjih je v porastu razvoj tehnologij posamične celice B, ki omogočajo pripravo človeških monoklonskih protiteles iz posamične celice B imuniziranih darovalcev. V okviru doktorske disertacije smo želeli uporabiti obstoječe tehnologije in metode ter jih izboljšati in prilagoditi na razpoložljivo opremo v laboratoriju. Darovalcem, cepljenim proti virusu hepatitisa B smo odvzeli periferno kri 7. in 14. dan po poživitvenem odmerku cepiva, saj je takrat v krvi prisotnih največ za antigen specifičnih celic B. Ključni koraki pri optimizaciji postopka so bili izbira prave tehnologije za osamitev posamične specifične celice B, postavitev učinkovitega protokola za RT-PCR iz posamične celice B in razvoj metode za preverjanje specifičnosti proizvedenih monoklonskih protiteles. Ločevanje celic na celičnem ločevalcu se je za osamitev posamične specifične celice B izkazalo za najbolj zanesljivega. Učinkovitost ločevanja smo povečali s predhodnim dodatnim korakom obogatitve celic B. Kljub manjšemu naboru površinskih označevalcev ločevanja (CD19, CD27, IgG in BCR za HBsAg) od prejšnjih študij, smo uspešno osamili za HBsAg specifične plazmatske in spominske celice B. Delež omenjenih specifičnih celic je bil 0,05-0,07 % od vseh celic B, osamljenih iz periferne krvi cepljenih darovalcev. Najbolj uspešen postopek za obratni prepis mRNA variabilnih genskih segmentov je bil protokol z reverzno transkriptazo SuperScriptIV in naključnimi oligonukleotidi. Za pomnoževanje produkta obratnega prepisa je bil najuspešnejši protokol z degeneriranimi začetnimi nukleotidi in polimerazo KAPAHifi. S kloniranjem variabilnih delov v plazmid smo uspeli pripraviti 5 plazmidov z variabilnim delom težke verige in 5 plazmidov z variabilnim delom lahke kapa verige. Po kotransfekciji parov plazmidov v sesalčjo linijo HEK293T/17 je 70 % od transficiranih celic proizvajalo protitelesa. Za preverjanje specifičnosti pripravljenih protiteles smo razvili specifični HBsAg ELISA test, ki je pokazal, da imajo tri pripravljena protitelesa sposobnost vezave na HBsAg. Postavili smo preprost in učinkovit postopek za pripravo rekombinanatnega monoklonskega protitelesa iz posamične celice B iz periferne krvi imuniziranih darovalcev na modelu hepatitisa B, s katerim lahko pripravimo specifično človeško monoklonsko protitelo tudi proti drugim antigenom za uporabo v raziskavah ali na področju personalizirane biomedicine.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: človeško monoklonsko protitelo, posamične celice B, virus hepatitisa B
• Vrsta gradiva: Doktorsko delo/naloga
• Organizacija: MF - Medicinska fakulteta
• Leto izida: 2024
• PID: 20.500.12556/RUL-165242
• Datum objave v RUL: 28.11.2024

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Optimization of the method for generating human monoclonal antibodies from peripheral blood of vaccinated donors on the model of Hepatitis B Virus

Izvleček

Due to their unique properties, recombinant human monoclonal antibodies represent an important class of biological therapeutics. Over the past two decades, single B cell technologies have increasingly enabled the development of human monoclonal antibodies from individual B cells of immunized donors. In this doctoral dissertation, we aimed to utilize existing technologies and methods, improving, and adapting them to the equipment available in our laboratory. Blood samples were collected from donors vaccinated against hepatitis B virus on days 7 and 14 after a booster immunization when the presence of antigen-specific B cells is at its highest. The key optimization points in our procedure were selecting the appropriate technology for isolating specific, individual B cells, establishing an efficient RT-PCR protocol from single B cells, and developing a selection method for the specificity of the produced monoclonal antibodies. Cell sorting was found to be the most reliable method for isolating individual, specific B cells. An additional pre-enrichment step further improved the isolation efficiency. Despite using a smaller panel of surface markers (CD19, CD27, IgG, and HBsAg BCR) compared to previous studies, we successfully isolated HBsAg-specific plasmablasts and memory B cells. These specific cells accounted for 0.05-0.07 % of all B cells isolated from the peripheral blood of vaccinated donors. The most successful protocol for reverse transcription of mRNA variable gene segments utilized SuperScript IV reverse transcriptase with random oligonucleotides. Amplification of the reverse-transcribed products was most effective when following a protocol with degenerate primers and KAPA HiFi polymerase. By cloning the variable regions into vectors, we successfully generated 5 vectors with the variable region of the heavy chain, and 5 vectors with the variable region of the kappa light chain. After co-transfection of vector pairs into the HEK293T/17 cell line, 70% of the transfected cells produced recombinant antibodies at an average concentration of 4 μg/ml. We developed a specific HBsAg ELISA test, to verify the specificity of the produced antibodies, which showed the binding of three antibodies to HBsAg. We established a simple and efficient protocol for generating recombinant monoclonal antibodies from individual B cells isolated from the peripheral blood of immunized donors, using the hepatitis B model. Furthermore, the described protocol can be used to generate human monoclonal antibodies to any other antigen for basic research or personalized medicine applications.

• Ključne besede: human monoclonal antibody, single B cells, hepatitis B virus