Vrednotenje metode za določanje prisotnosti virusa SARS-CoV-2 na osnovi obratne transkripcije in multiple verižne reakcije s polimerazo v različno odvzetih vzorcih sline

Pusser, Katarina (avtor), Šmid, Alenka (mentor), Benčina, Mojca (komentor)

Decembra 2019 so se v Wuhanu na Kitajskem prvič začele pojavljati okužbe z novim koronavirusom SARS-CoV-2, ki so se kmalu sunkovito razširile po svetu. Kužnost virusa je visoka, saj ena okužena oseba v povprečju okuži dve do tri zdrave osebe. Za namene diagnosticiranja okužbe poznamo več metod, med katerimi ostajajo zlati standard molekularni testi, ki temeljijo na RT-PCR metodi. Vzorci so najpogosteje pridobljeni iz enostavno dostopnih območij, kot je nosno-žrelni bris. Ti brisi so neprijetni za odvzem in predstavljajo veliko tveganje za prenos okužbe na zdravstveno osebje, zato se za namene množičnega testiranja raziskujejo dodatne možnosti vzorčenja. Slina predstavlja potencialni alternativni vzorec za detekcijo okužbe, zato se ji na področju razvijanja testov v zadnjem času namenja veliko pozornosti. Vzorčenje sline je neinvazivno, ugodnejše in predstavlja manjše tveganje za prenos okužbe na osebje. V namene proučevanja sline smo vzpostavili multiplo RT-qPCR metodo. Določili smo analizno občutljivost 3 kopij virusne RNA/reakcijo oz. 3000 kopij/mL. Naša metoda tako ustreza intervalu zaznavnosti odobrenih metod s strani Evropske komisije in je dovolj občutljiva, da zazna virus v slini pred pojavom simptomov. Metodo smo ovrednotili z različno odvzetimi vzorci sline. Primerjali smo vzorce pridobljene s slinjenjem, rejonsko in najlonsko palčko. Rezultate testiranja vzorcev smo primerjali z vzorci nosno-žrelnega brisa, ki jih je preiskovancem odvzelo zdravstveno osebje za namene splošnega testiranja na virus. Potrdili smo, da način odvzema vzorca sline vpliva na diagnostično občutljivost, ne vpliva pa na diagnostično specifičnost testa. Najboljše rezultate daje odvzem vzorca s slinjenjem s skupno občutljivostjo 85 % pri Cp < 30. Vzorci, pridobljeni s slinjenjem, imajo prav tako najboljše ujemanje z rezultati vzorcev nosno-žrelnega brisa, uradno potrjene metode iz NLZOH (90 % pri Cp < 30). Zbiranje sline s slinjenjem je torej primeren način pridobivanja vzorca. Nato smo primerjali klinično-diagnostične lastnosti naše metode za vzorce slinjenja s primerljivimi metodami, izvedenimi na Kemijskem inštitutu (KI) in Nacionalnem inštitutu za biologijo (NIB). Preverjali smo vpliv reakcijskega volumna na rezultate testiranja, saj smo na Fakulteti za farmacijo izvedli multiplo RT-qPCR z manjšimi reakcijskimi volumni kot na KI in NIB. S primerjavo smo potrdili, da je uporaba večjih volumnov primernejša. Pri manjših volumnih smo dobili več lažno negativnih rezultatov, kar se kaže v slabši občutljivosti.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: SARS-CoV-2, RT-qPCR, diagnostična metoda
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Leto izida: 2021
• PID: 20.500.12556/RUL-134132
• Datum objave v RUL: 24.12.2021

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Evaluation of multiplex reverse transcriptase - polymerase chain reaction for detection of SARS-CoV-2 virus in differently collected saliva samples

Izvleček

In December 2019 the first reports of infections with the new SARS-CoV-2 coronavirus appeared in Wuhan, China. The virus spread rapidly around the world. SARS-CoV-2 is very contagious since one infected person passes the virus on to three healthy individuals. Different diagnostic methods are used for the detection of the virus; however, RT-PCR remains the gold standard. Samples are usually taken from easily accessible areas, for example, the nasopharyngeal area. Unfortunately, nasopharyngeal swabs are unpleasant for patients and present a risk for infection of healthcare workers. Lately, saliva samples are being considered for mass testing. The collection of saliva is non-invasive, affordable, and presents lower risk for healthcare workers. A study aimed to design a diagnostic method, based on RT-qPCR for the detection of the SARS-CoV-2 virus in differently collected saliva samples. The analytical sensitivity of the method is 3 copies of viral RNA/reaction (3000 copies/mL), meaning that it is within the wide range of analytical sensitivities of officially approved methods on the European Commission page. We also confirmed that the method can detect the virus in saliva before symptom onset. Afterward, the method was evaluated with differently collected saliva samples. We compared saliva samples collected with nylon and rayon swaps from the mouth and by passive drooling. Samples were paired with nasopharyngeal swabs, which were analysed at the National diagnostic centre using the officially approved PCR method. We established that the saliva sampling techniques significantly affect diagnostic sensitivity, but not diagnostic specificity. The best sensitivity was obtained for the saliva samples collected as passive drool (85 % for Cp < 30). Furthermore, passive drool saliva has the highest concordance with nasopharyngeal swabs (90 % for Cp < 30). The conclusion is that saliva collected by passive drool outperformed mouth swabs in a SARS-CoV-2 detection. In the end, we evaluated the clinical-diagnostic parameters of our method in comparison to the RT-qPCR methods from the National Institute of Chemistry (KI) and National Institute of Biology (NIB). We compared the results from passive drool saliva samples. We evaluated the effect of reaction volume sizes to test results. For our RT-qPCR method, smaller reaction volumes were used compared to methods from KI and NIB. We managed to confirm that bigger reaction volumes are more suitable, due to the higher rate of false-negative results in smaller volumes, which leads to lower diagnostic sensitivity.

• Ključne besede: SARS-CoV-2, RT-qPCR, diagnostic method