Priprava skrajšanih oblik proteina FHL2 in analiza njihovih interakcij z β-kateninom

Gašperšič, Laura (avtor), Gaber, Aljaž (mentor)

Nepravilnosti v delovanju in regulaciji signalnih poti v celicah prispevajo k razvoju bolezenskih stanj in rakavih obolenj. Med že znanimi potmi, ki močno vplivajo na razvoj tumorjev, je tudi signalna pot Wnt, pri kateri kot ključni protein sodeluje β‑katenin. Z vezavo s transkripcijskim faktorjem Lef-1 spodbuja proliferacijo celic in napredovanje celičnega cikla. Do aktivacije izražanja podobnih genov pa lahko pride tudi ob tvorbi kompleksa EpIC–FHL2–β‑katenin–Lef-1. Nastanek kompleksa se začne v citosolu po regulirani znotrajmembranski proteolizi proteina EpCAM, pri čemer nastane konstrukt EpIC. Le ta interagira z β‑kateninom in FHL2, v jedru pa se v kompleks veže še Lef-1. Interakcija med proteini tega kompleksa je že potrjena, so pa podatki pomanjkljivi in zahtevajo dodatne analize. V okviru magistrskega dela smo želeli natančneje okarakterizirati domene, ki sodelujejo pri interakcijah med omenjenimi proteini, in sicer z uporabo dveh različnih metod, ki analizirata interakcije med proteini (test zadrževanja in z analizo statičnega sipanja svetlobe z napravo OmniSEC). Pri delu smo najprej pripravili vse ustrezne vektorje za izražanje fluorescenčno označenih ter neoznačenih proteinov. Pri izražanju v bakterijskih celicah E. coli in čiščenju nekaterih rekombinantnih proteinov smo naleteli na težave, poleg tega pa pri interakciji med fluorescenčno označenimi proteini pride do drugačne stehiometrije udeleženih proteinov kot pri interakciji med neoznačenimi proteini, zato analiz s testom zadrževanja nismo izvedi. Za analize z napravo OmniSEC smo izrazili in očistili tako celotne kot skrajšane oblike proteinov FHL2 in β‑katenina. Pri tem smo pri nekaterih konstruktih opazili visoko stopnjo obarjanja, zato jih zaradi občutljivosti metode za končne analize z napravo OmniSEC nismo uporabili. Na podlagi pridobljenih rezultatov lahko sklepamo, da je za interakcijo med FHL2 in β‑kateninom pomembna tretja domena proteina FHL2 (LIM3), stabilno interakcijo pa tvori le celoten protein FHL2. Vzorec obarjanja skrajšanih konstruktov proteina FHL2 nakazuje možnost nastanka intramolekularne interakcije med domenama LIM0 in LIM2, ki preprečuje intermolekularno interakcijo med domenama LIM1 in LIM2 med sosednjimi molekulami. Ob odsotnosti domene LIM0 tako lahko pride do dimerizacije in obarjanja skrajšanih konstruktov. Dobljeni rezultati predstavljajo vpogled v interakcije med proteinom FHL2 in β‑kateninom, ki sta del kompleksa EpIC–FHL2–β‑katenin–Lef-1, vendar so za natančno poznavanje interakcij potrebne še dodatne raziskave. Magistrska naloga služi kot podlaga za izražanje in čiščenje uporabljenih proteinskih konstruktov, pri čemer pa je potrebna optimizacija pogojev čiščenja (uporaba drugačnih pufrov). Možnost izvedbe testa zadrževanja bi doprinesla pomembne informacije o interakcijah med proteini kompleksa in možnosti za boljše načrtovanje zdravil, ki bi regulirala delovanje tega kompleksa.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: proteinske interakcije, FHL2, β‑katenin, OmniSEC
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Tipologija: 2.09 - Magistrsko delo
• Organizacija: FKKT - Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
• Leto izida: 2024
• PID: 20.500.12556/RUL-159303
• COBISS.SI-ID: 203511555
• Datum objave v RUL: 05.07.2024

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Preparation of truncated forms of FHL2 analysis of their interaction with β-catenin

Izvleček

Malfunctions and deregulation of signaling pathways within cells can lead to diseases and cancer. Among known signaling pathways affecting tumorigenesis is the Wnt signaling pathway, in which the key protein involved is β‑catenin. Through interaction with a transcriptional factor Lef-1, it promotes cell proliferation and cell cycle progression. Activation of transcription of similar genes can also be caused by the formation of a protein complex EpIC–FHL2–β‑catenin–Lef-1. After the regulated intramembrane proteolysis of the EpCAM protein, the EpIC part is released in the cytosol, where it interacts with β‑catenin and FHL2. In the cell nucleus, protein Lef-1 binds to the complex. Complex formation and interactions between proteins have already been confirmed, but current data regarding interactions is incomplete and requires further analysis. In the scope of this master thesis, we aimed to characterize protein domains involved in interactions between mentioned proteins, using two different methods to identify interacting domains (HoldUp assay and analysis with OmniSEC system). First, we prepared vectors to express both fluorescently labelled and unlabelled proteins. During the expression in E. coli cells and purification of certain recombinant proteins, we encountered challenges. Additionally, the interaction between fluorescently labeled proteins resulted in a different stoichiometry of participating proteins compared to the interaction of unlabelled proteins. Hence, we did not perform the HoldUp assay. For OmniSEC analyses, we expressed and purified full-length and truncated FHL2 in β‑catenin. Some of the constructs exhibited high precipitation in used buffers, leading us to exclude them from the OmniSEC analysis due to the method’s sensitivity. Based on the obtained results, we can conclude that the third LIM domain of the FHL2 protein (LIM3) is important for its interaction with β‑catenin, but only the full-length FHL2 can form a stable interaction. The precipitation pattern of truncated forms of FHL2 suggests the possibility of an intramolecular interaction between the LIM0 and LIM2 domains, which prevents the intermolecular interaction of domains LIM1 and LIM2 of neighbouring molecules. In the absence of the LIM0 domain, dimerization and precipitation of the truncated forms of FHL2 can occur. Results obtained in this master thesis provide insights into the interaction between FHL2 and β‑catenin, which are part of the EpIC–FHL2–β‑catenin–Lef-1 complex, however further research is necessary for a precise understanding of these interactions. This master thesis can serve as a basis for the expression and purification of and purifying used protein constructs, but the purification conditions still need to be optimized (using different buffers). The possibility of performing the HoldUp assay would provide essential data about interactions and enhance the design of targeted drug development.

• Ključne besede: protein interaction, FHL2, β‑catenin, OmniSEC