Živo srebro je tekoča prehodna kovina, ki se je v preteklosti pogosto uporabljala v znanosti, industriji in tehnologiji. Zaradi toksičnih lastnosti različnih zvrsti Hg, je njegova uporaba danes zelo omejena. Kljub temu je Hg zaradi stoletij rudarjenja, deponiranja odpadkov in bioakumulacije še vedno prisotno v okolju. Največja nahajališča Hg so v območju Mediterana, med katere je spadal tudi rudnik živega srebra v Idriji. Slovenija ima pomembno vlogo v raziskavah Hg poleg rudnika v Idriji tudi zaradi dela skupine za Hg na Inštitutu Jožef Stefan pod vodstvom prof. dr. Milene Hrovat, ki vključuje študije o vplivih Hg na okolje in napredke v metodologiji zaznavanja Hg. V naravnem ciklu Hg reagira z različnimi molekulami in organizmi in tako spreminja svoje oksidacijsko stanje in koordinacijsko sfero. Proces v katerem se Hg odloži v globokih oceanskih in talnih sedimentih in ni več mobilen, lahko traja več stoletij. Vse zvrsti Hg so strupene, med njimi pa je najbolj nevarna metil živo srebro (MeHg$^+$), nevrotoksin, ki nastanja kot produkt metilacije raztopljenih Hg2+ ionov, ki poteka v nekaterih anaerobnih vrstah bakterij. MeHg$^+$ je bil v preteklosti razlog za največje ekološke katastrofe z zastrupitvijo s Hg. Zmožnost metilacije Hg je odvisna od ligandov, vezanih na Hg2+ ione, saj večje molekule zmanjšajo sposobnost bakterij za spremembo Hg$^{2+}$ v strupeni MeHg$^+$.
Poznavanje kinetike in termodinamike med Hg in potencialnimi ligandi bi nam omogočilo napovedovanje reakcij Hg, ki je zaradi onesnaženja raztopljen v vodnih okoljih. Hg se v naravi večinoma veže na spojine, ki vsebujejo tiolne funkcionalne skupine. Ena od takih vrst spojin, ki jih je zlasti v naravnih vodah veliko, je naravna organska snov (NOM). NOM je kompleksna mešanica v vodi raztopljenih organskih spojin z veliko koncentracijo molekul, ki vsebujejo tiolne skupine. Doslej so bile opravljene številne študije o termodinamiki med Hg in NOM, medtem ko kinetika teh reakcij še ni bila temeljito preučena. Predvideva se, da se Hg$^{2+}$ najprej veže na ligande z nizko molekulsko maso in se nato preko izmenjav ligandov preusmeri v večje komplekse.
Glavni cilj magistrskega dela je bil raziskati kinetiko reakcij izmenjave ligandov kompleksov Hg s tioli v NOM in cisteinom (cys). Cys smo uporabili kot konkurenčni ligand, saj vsebuje tiolno skupino in tvori primerljivo močne vezi z Hg$^{2+}$ ioni kot NOM. NOM je bil pridobljen iz reke Suwannee v jugovzhodnih ZDA in filtriran v različne velikostne frakcije. V tem magistrkem delu smo preučevali tri frakcije NOM naslednjih velikosti; <1 kDa, 3−5 kDa in 5−10 kDa. Pri reakcijah, ki so ustrezale osnovnim kinetičnim modelom, smo izračunali reakcijske hitrosti. Rezultate smo primerjali tudi s predhodno preliminarno raziskavo, ki je vključevala NOM sestavljen iz vseh frakcij.
Spremljali smo dve vrsti reakcij med Hg, cys in NOM. Prva reakcija je zajemala sintezo kompleksa Hg(cys)$_2$, ki je nato reagiral z NOM. Reakcijo smo spremljali pet dni. V drugi vrsti reakcij smo najprej sintetizirali kompleks Hg(NOM), ki smo mu nato dodali cys. Reakcijo smo spremljali dva dneva. V obeh primerih smo cys dodali v dvakratnem stehiometričnem presežku glede na Hg. Reakcije in raztopine reagentov smo pripravili v inertni dušikovi atmosferi in z N$_2$ prepihanimi topili, saj so tiolne spojine zelo občutljive na O$_2$. Za vsako reakcijo smo vzporedno izvedli tudi kontrolno reakcijo. V točno določenih časovnih intervalih smo vzeli vzorce reakcij za analizo koncentracije Hg(cys)$_2$.
Za ločevanje in merjenje koncentracije kompleksa Hg(cys)$_2$ smo uporabili visoko ločljivostno tekočinsko kromatografijo (HPLC) povezano z masno spektrometrijo z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS). Ti metodi smo uporabili, saj HPLC zagotavlja visoko-resolucijo in hitro ločbo komponent v reakcijskih mešanicah, ICP-MS pa omogoča izjemno natančno merjenje koncentracije izotopov težkih kovin, kot je Hg. Kot mobilno fazo v HPLC smo uporabili 3,5 % vodno raztopino 1-propanola, ki smo ji pH uravnali z mravljično kislino do pH 3. Analite smo z izokratsko elucijo ločili na bifenilni stacionarni fazi. Stacionarno fazo smo po meritvah spirali z 20 % raztopino 1-propanola. Parametre ICP-MS inštrumenta smo optimizirali za detekcijo Hg izotopov. Metodo smo potrdili s kalibracijsko premico pripravljenih standardnih raztopin Hg(cys)$_2$, ki je bila linearna v koncentracijskih območjih načrtovanih eksperimentov. Izkazalo se je, da pH mobilne faze pomembno vpliva na način elucije Hg(cys)$_2$, saj smo pri uporabi dveh mobilnih faz z rahlo drugačnim pH opazili en oziroma dva kromatografska vrhova. Pojava dodatnega vrha smo pripisali odvisnosti protoniranega stanja karboksilne skupine cys v odvisnosti od pH. Poleg koncentracije Hg(cys)$_2$ smo s tehniko generiranja hladnih par sklopljeno z ICP-MS določili tudi koncentracijo celokupnega Hg v izbranih vzorcih.
Prvi tip reakcij smo izvedli z 0,1 μM Hg(cys)$_2$ in 9 mg/L NOM. Po 5 dneh se koncentracija Hg(cys)$_2$ ni spremenila, opazili pa smo tudi nestabilnost koncentracije kontrolne reakcije, ki je bila pripisana degradaciji Hg(cys)$_2$ na bifenilni koloni. Z namenom povečanja koncentracije tekmujočih NOM molekul in povečanja občutljivost metode na spremembe v koncentraciji in zmanjšanja vpliva degradacije Hg(cys)$_2$ smo vse naslednje reakcije izvedli z 0.5 μM Hg(cys)$_2$ in 210 mg/L NOM. Pri prvi reakciji smo za raziskane velikostne frakcije dosegli naslednje rezultate. Pri NOM < 1kDa, se koncentracija Hg(cys)$_2$ ni pomembno spremenila, zato izmenjave ligandov nismo predpostavili. Pri frakciji 3−5 kDa smo predpostavili ničelni reakcijski red, saj se je koncentracija reaktanta spreminjala linearno s časom. Z uporabo enačbe [A]=[A]$_0$-kt smo izračunali velikost reakcijske konstante 4×10-4 μMh$^{-1}$. Pri frakciji 5−10 kDa smo prav tako predpostavili 0. red reakcije in izračunali velikost konstante 3×10$^{-4}$ μMh$^{-1}$. Zaradi nepojasnjenih nihanj v koncentraciji v prvi uri reakcije je bilo ujemanje modela s podatki slabo. Ko smo pri računanju modela izpustili koncentracije v prvi uri eksperimenta, smo izračunali velikost konstante 8×10$^{-4}$ μMh$^{-1}$, ujemanje modela pa je bilo veliko boljše. Med reakcijami z vsemi velikostnimi frakcijami NOM nismo opazili izgube celotnega Hg.
Pri vseh treh velikostnih frakcijah izvedene druge reakcije so bili rezultati podobni, saj je Hg(cys)$_2$ hitro nastal in nato ohranjal konstantno koncentracijo ves čas poskusa. Na koncu poskusov je bila majhna količina Hg$^{2+}$ še vedno kompleksirana z NOM. Opaženo izgubo celotnega Hg med temi reakcijami, v povprečju 33 %, smo pripisali redukciji Hg$^{2+}$ z NOM v fazi vzpostavljanja ravnotežja in poznejšemu izhlapevanju Hg$^0$.
Ugotovili smo, da je bila največja opazovana frakcija NOM 5−10 kDa najuspešnejša pri tekmovanju s cys pri kompleksiranju Hg$^{2+}$. Predvideva se, da frakcije NOM z molekulsko maso nad 10 kDa kažejo enako ali večjo afiniteto do Hg$^{2+}$ kot frakcija 5−10 kDa. Podana sta dva možna razloga, zakaj se tiolne spojine z večjo molekulsko maso v NOM močneje vežejo na Hg$^{2+}$ kot tiolne spojine z manjšo molekulsko maso. 1) koncentracija spojin, ki vsebujejo tiolno skupino, je lahko višja v večjih frakcijah NOM, 2) vezavna konstanta za Hg$^{2+}$ spojin, ki vsebujejo tiol, je višja za spojine v večjih frakcijah NOM.
Smiselno nadaljevanje tega projekta bi vključevalo ponovitev istih poskusov s preostalimi večjimi frakcijami NOM: 10−30 kDa, 30−100 kDa in >100 kDa. Pomembna meritev, ki še ni bila opravljena, se nanaša na merjenje koncentracije tiolnih spojin za različne velikosti frakcij NOM. Koncentracijo tiolov bi lahko določili s titracijo Hg$^{2+}$, ki bi jo spremljali s Hg L$_{III}$-edge EXAFS, ki je že bila uporabljena za določitev koncentracije tiolov v celotni seriji NOM. Te dodatne informacije bi pokazale, ali večje frakcije NOM močneje vežejo Hg$^{2+}$ zaradi večje koncentracije tiolnih spojin ali zaradi večje afinitete do Hg.
|
