Ločba enantiomerov antagonistov P2RX7 z uporabo superkritične tekočinske kromatografije na analizni in preparativni skali

Knavs, Naomi (avtor), Pajk, Stane (mentor), Lipka, Emanuelle (komentor)

Kiralnost spojin igra zelo pomembno vlogo v vsakdanjem življenju. Ni prisotna le na področju kemije, temveč tudi na področjih matematike, fizike in biologije. V človeškem telesu so na primer aminokisline, ki tvorijo beljakovine, številni lipidi, žive celice, polisaharidi in tudi človeški dedni material, znan kot dvojna vijačnica DNK, kiralni. Izvor kiralnosti v življenju je še vedno nejasen, vendar ima zelo velik vpliv na večino bioloških mehanizmov. Stereoizomerija je danes ključni dejavnik v farmacevtski industriji. V preteklosti so zdravila tržili v obliki racemata. Eden prelomnih dogodkov v farmacevtski zgodovini je predstavljal primer zdravila Talidomid, ki je z zastrupitvijo zarodka, v šestdesetih letih prejšnjega stoletja, povzročil svetovno tragedijo prirojene invalidnosti. Medtem ko je (R)-Talidomid dal želene farmakološke učinke je (S)-talidomid povzročil neželene stranske učinke. Posamezni enantiomeri lahko zaradi nestabilnega kiralnega centra med seboj racemizirajo. Hitra konfiguracijska inverzija se lahko zgodi in vivo, katalizirajo pa jo encimi. Primer Talidomida je povečal ozaveščenost o različnem farmakološkem profilu zdravil s kirlanim centrom in o prednostih uporabe kiralnega zdravila v obliki enega enantiomera. Od leta 1992 so vladni predpisi o varnosti in učinkovitosti zdravil postali strožji glede spojin, ki so kiralne. Kadar lahko spojina obstaja v več različnih stereokemičnih konfiguracijah je potrebno pri eksperimentalnem delu ločiti prisotne stereoizomere ter testirati biološke učinke vsakega stereoizomera posebej, saj ima lahko en stereoizomer povsem drugačne učinke v primerjavi z drugim. V večini primerov eden od stereoizomerov zagotavlja boljše ujemanje s tarčo zdravila in kaže želeno aktivnost. Posledično se dotični stereoizomer obravnava kot aktivna substanca (API). Nasprotno od tega se drugi stereoizomer obnaša drugače in ne kaže nobene aktivnosti, povečano aktivnost ali pa predstavlja potencialno toksično nevarnost za človeško telo. Stereoizomeri so izomeri z enakimi molekulskimi formulami in razporeditvijo atomov. Med seboj se razlikujejo le po prostorski orientaciji substituentov na centralnem atomu. Na splošno je v organski kemiji kiralnost posledica štirih različnih substituentov vezanih na centralni ogljikov atom, zaradi česar nastane asimetrični ogljikov atom, znan tudi kot kiralni center. Zrcalne slike stereoizomerov se imenujejo enantiomeri ali optični izomeri. Diastereoizomeri se razlikujejo po fizikalno-kemijskih lastnostih, kot so tališče, gostota in kemijska reaktivnost, medtem ko imajo enantiomeri enake fizikalno-kemijske lastnosti, vendar se razlikujejo po vrtenju ravninsko polarizirane svetlobe v nasprotni smeri. Kiralne metode ločevanja, pri katerih se enantiomeri ločujejo na analizni in preparativni ravni, so pomemben dejavnik pri razvoju zdravil. Najpogostejša kromatografska metoda za ločevanje enantiomerov ostaja tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC), poznamo pa tudi ostale separacijske tehnike, kot so plinska kromatografija (GC), superkritična tekočinska kromatografija (SFC), kapilarna elektroforeza (CE) in tankoplastna kromatografija (TLC). Ločevanje stereoizomerov s SFC in HPLC ostajata na globalni ravni dve najpogosteje uporabljeni separacijski metodi. Sodobna superkritična tekočinska kromatografija je okolju prijazna separacijska tehnika, podobna plinski in tekočinski kromatografiji. Uporablja se za analizo, čiščenje in separacijo kiralnih ter akiralnih spojin. Za mobilno fazo se za razliko od HPLC uporablja superkritična tekočina. Najpogosteje temu namenu služi CO2 v superkritičnem stanju. Prednosti CO2 so svetovna dostopnost in relativno nizka cena, nevnetljivost in relativno nizki superkritični pogoji (31,1 䑒C in 7,36 MPa). Pri separaciji polarnih molekul k nepolarnemu topilu, ki je v našem primeru superkritični CO2, dodamo so-topilo, ki služi kot modifikacijsko sredstvo. Najpogosteje se kot so-topilo uporablja alkohole: etanol, metanol, acetonitril, 2-propanol idr. Z operativnega vidika je SFC preprost in zanesljiv, tako kot HPLC, vendar je pri SFC zbiranje frakcij bolj priročno, ker primarna mobilna faza izhlapi in ostane le analit in majhen volumen polarnega so-topila. Pri pripravi vzorcev upoštevamo navodilo, da je vsaka molekula, ki se bo raztopila v metanolu ali manj polarnem topilu, združljiva s SFC, vključno s polarnimi topljenimi sredstvi. CO2 je po polarnosti podoben n-heptan-u. Pomemben dejavnik pri vsaki kromatografiji je izbira stacionarne faze. Kolone, ki jih uporabljamo pri SFC analizi se uporabljajo tudi pri HPLC analizi. Gre namreč za kolone, ki temeljijo na osnovi silika. Za kiralno separacijo se uporabljajo kolone s kiralno stacionarno fazo (CSP). Ločevanje enantiomerov je pretežno posledica stereoselektivnih interakcij s CSP, žal pa je napovedovanje teh interakcij še neraziskano področje, zato je zelo težko napovedati vrstni red ločevanja in elucije samo na podlagi kemijske strukture analitov. Pri kiralni SFC je CSP najbolj kritičen parameter za doseganje kiralne ločljivosti kot pri HPLC. Univerzalnega kiralnega selektorja, ki bi lahko ločil raznoliko mešanico stereoizomerov še ne poznamo. Za eksperimentalno rešetanje se uporablja več kolon in kombinacij mobilnih faz z namenom dosega najprimernejše enantiomerne selektivnosti. Na voljo je več kot 100 komercialno dostopnih kolon, med katerimi so najpogosteje uporabljeni (imobilizirani) polisaharidi, ciklodekstrini, makrociklični, glikopeptidi, Pirklov tip kolon, ionsko izmenjevalni tip kolon in kronski etri. Kiralne stacionarne faze so zelo drage zaradi dragega kiralnega selektorja, ki mora biti visoke enantiočistosti, in po drugi strani zaradi odstranjevanja derivatizacijskega sredstva, da se po separaciji obnovijo prosti enantiomeri. Namen študije je bil izvesti kiralno enantio-selektivno separacijo z uporabo superkritične tekočinske kromatografije na novo sintetiziranih potencialnih antagonistov P2RX7 za zdravljenje vnetnih bolezni, kot sta Crohnova bolezen in ulcerozni kolitis. Receptor P2RX7, ki spada v družino purinergičnih receptorjev, je od liganda odvisen neselektivni ionski kanal, odvisen od koncentracije ATP. Funkcionalni ionotropni receptor P2RX7 je široko izražen v različnih človeških tkivih in organih, kot so krvotvorne matične celice in njihove linije, vključno z monociti, makrofagi, mastociti ter limfociti B ali T, ter sodeluje pri različnih fizioloških in patoloških dejavnostih. Ni presenetljivo, da je receptor P2RX7 pomemben za normalno hematopoezo in levkemogenezo. Številni antagonisti receptorja P2RX7 so bili razviti z namenom zdravljenja bolezni, povezanih z vnetjem, neoangiogenezo in poškodbami živčevja, saj se je izkazalo, da P2RX7 sodeluje pri proliferaciji in smrti celic. Razdelimo jih lahko na ortosterske ligande, ki vežejo receptor v votlini za vezavo ATP-ja in alosterične ligande, ki vežejo receptor na mestih, ki niso v votlini za vezavo ATP-ja ter zmanjšujejo učinek endogenega liganda ATP. Mentorica s fakultete za farmacijo v Lillu, dr. Emmanuelle Lipka, že več let sodeluje s kemijskim laboratorijem HEI (Hautes Etudes pour l'Ingénieur), povezanim z laboratorijem INSERM (Institut national de la santé et de la recherche médicale). Trenutno se znanstveniki omenjenega laboratorija ukvarjajo s sintezo novih potencialnih antagonistov receptorjev P2RX7. Skupina kemikov iz omenjenega laboratorija je sintetizirala vrsto spojin, ki so potrebovale nadaljnjo analizo. Sintetizirane spojine so imele od enega do treh kiralnih centrov. Deset na novo sintetiziranih spojin smo analizirali na enajstih različnih kiralnih analitskih kolonah s štirimi različnimi so-topili, ki so služili kot modifikacijsko sredstvo k mobilni fazai, z namenom določitve optimalnih pogojev ločevanja za vsako spojino posebej. Hkrati smo opravili analizo enakih spojin na petih HPLC kolonah (normalno-fazna kromatografija), da bi lahko neposredno primerjali obe analizni tehniki ločevanja. Po končanem »screeningu« ali rešetanju smo izbrali dve spojini, ki sta iz biofarmacevtskega vidika kazali najboljšo biološko aktivnost in izvedli preparativno in produktivno separacijo (povečanje obsega ali »scale-up«). Cilj je bil pridobiti nekaj miligramov vsakega stereoizomera posebej, da bi nadalje raziskali njihovo biološko aktivnost. Za vse spojine z enim kiralnim centrom smo uspeli določiti optimalne pogoje za separacijo vseh stereoizomerov. Zaradi prevelike vsebnosti nečistoč je bila analiza prekinjena na eni od spojin z dvema kiralnima centroma. Za dve spojini z dvema kiralnima centroma smo določili primerne pogoje za ločevanje vseh diastereoizomerov, za eno spojino pa nam to žal ni uspelo. Spojini s tremi kiralnimi centri nismo uspeli določiti idealnih pogojev za ločitev vseh diastereoizomerov niti na SFC niti na HPLC. Za nadaljnje preiskave smo izbrali dve spojini, metodo uspešno nadgradili do preparativnega obsega in pridobili nekaj miligramov vsakega stereoizomera posebej za nadaljnje biološke preiskave.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: Superkritična Tekočinska Kromatografija, Tekočinska Kromatografija, Ločba Enantiomerov, Receptor P2RX7, Vnetni Pocesi
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Leto izida: 2023
• PID: 20.500.12556/RUL-151597
• Datum objave v RUL: 12.10.2023

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Analytical and preparative scale enantioseparation using supercritical fluid chromatography of P2RX7 antagonists

Izvleček

Chirality plays a central role in the world around us. It is not only present in the world of chemistry but also in the subdomain of mathematics, physics and biology. For instance, in the human body, protein-making amino acids, monosaccharides, and the human hereditary material known as the DNA double helix are chiral. Stereoisomerism is nowadays a critical factor in pharmaceuticals. In the past, pharmaceuticals were typically created as mixtures containing both left-enantiomeric (S) and right-enantiomeric (R) forms of molecules, known as racemic mixtures. However, since 1992, regulatory requirements for drug safety and effectiveness have become more stringent, especially concerning compounds with different spatial arrangements. This means that when a new pharmaceutical compound can exist in various structural configurations, conducting experimental tests has become crucial. Identifying and characterizing the specific stereoisomers present and determining their individual biological effects have become essential, as one stereoisomer can display entirely distinct effects compared to another. Chiral separation techniques have become indispensable in the field of pharmaceutical drug development, whether on an analytical or preparative scale. These methods are vital for isolating and analyzing individual stereoisomers and have increasingly become the preferred techniques. Some commonly used chiral separation techniques include: Chiral Supercritical Fluid Chromatography (SFC), High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), Gas Chromatography (GC), Thin-Layer Chromatography (TLC), and Capillary Electrophoresis (CE). These techniques play a crucial role in ensuring the accurate assessment and isolation of specific stereoisomers, contributing to the development of safer and more effective pharmaceuticals. Chiral separations using SFC and HPLC are one of the most typical methods for purifying enantiomers. SFC is a separation technique that shares some similarities with both liquid chromatography (LC) and gas chromatography (GC), but still outlines some only for SFC characteristic features, such as using a supercritical fluid as the mobile phase. Modern SFC has due to its reduced solvent usage emerged as an environmentally friendly technique with many advantages and is slowly surpassing HPLC. SFC is particularly useful for the separation of compounds that are not easy to separated by traditional HPLC or GC methods. Furthermore, this separation technique can provide excellent resolution of enantiomers. The study aimed to perform chiral enantioseparation using supercritical fluid chromatography of newly synthesized potential P2RX7 antagonists for the treatment of inflammation related diseases such as Crohn’s disease and ulcerative colitis. Ten newly synthesised compounds were screened on eleven different chiral analytical columns with four different co-solvents as mobile phases to find optimal separation conditions for every compound separately. At the same time, we performed the screening on five HPLC columns to make a direct comparison between the two separation methods. Furthermore, two compounds indicating promising biological activity were chosen for upscale to preparative scale. The aim was to obtain a few milligrams of each stereoisomer separately to further investigate their biological activity. For compounds featuring a single chiral center, we successfully identified optimal separation conditions for their enantiomers. However, we had to discontinue screening one compound with two chiral centers due to excessive impurities. Among the compounds with two chiral centers, we managed to establish suitable conditions to separate all diastereoisomers for two of them. Unfortunately, despite extensive efforts, neither SFC nor LC provided ideal conditions for the separation of all diastereoisomers for the compound with three chiral centers. Subsequently, we selected two compounds from our investigations and successfully scaled up their purification processes to obtain a few milligrams of each stereoisomer, which will be further analyzed for biological assessments.

• Ključne besede: Supercritical fluid chromatography, Liquid chromatography, Enantiomer separation, P2RX7, Inflammation