Grobozrnate simulacije molekulske dinamike za preučevanje kompleksiranja različnih polietileniminov z malo interferenčno RNA

Trnovec, Lara (avtor), Štrukelj, Borut (mentor), Merkel, Olivia (komentor)

Polietilenimini (PEI) so skupina linearnih ali razvejanih polimerov, ki vsebujejo etilen (CH2CH2) in primarne, sekundarne ter terciarne amine kot njihove ponavljajoče se enote. Obstajajo linearni, razvejeni in dendrimerski polietilenimini z molekulskimi masami od 1 do 1000 kDa. Poleg tega lahko polietilenimini delujejo kot t.i. »protonske gobe,« in sicer zaradi svojih protoniranih amino skupin v endo-lizosomu povzročijo osmotsko neravnovesje zaradi influksa kloridnih ionov. Posledica tega je vdor vode, razteg ter razpoka endo-lizosoma ter sprostitev polipleksa. Polietilenimini so postali zlati standard za in vitro polimerne dostavne sisteme RNA in zato pogosto služijo kot standard za razvoj novih formulacij. Male interferenčne RNA so dvoverižne RNA molekule, sestavljene iz 21-23 nukleotidov z dolžino 7-8 nm in širino 2-3 nm. Pri RNA interferenci (RNAi) RNA molekule spodbudijo nevtralizacijo tarčnih mRNA molekul in posledično zavirajo izražanje genov. Terapija s siRNA molekulam je mejnik pri zdravljenju in obvladovanju bolezni. Za razliko od zdravil z majhnimi molekulami in protitelesi se lahko daje 2-4 krat letno. Druga prednost pri zdravljenju s siRNA je, da delujejo s popolnim združevanju Watson-Crick baz, namesto da bi delovale na tarčo z visoko specifičnostjo in afiniteto kot zdravila z majhnimi molekulami ali monoklonska protitelesa. Poleg tega lahko siRNA delujejo na kateri koli željen gen, če je poznano nukleotidno zaporedje mRNA. Za razliko od majhnih molekul ali protiteles imajo siRNA krajši cikel raziskav in razvoja ter širše terapevtsko okno. Pri aplikaciji siRNA se srečamo s številnimi problemi, in sicer degradacije nukleaz, kopičenja v željenem tkivu, prepoznavanja s strani imunskega sistema, nespecifično vezavo, učinkovit transport čez membrano ter uhajanje endosomov in lizosomov v citoplazmo. Stabilnost siRNA proti serumskim nukleazam in izogibanje imunskemu prepoznavanju je bilo izboljšano z uporabo kemijskih modifikacij, konjugacijo siRNA na specifične ligande ali enkapsulacijo v vezikle z nevtralnim površinskim nabojem. Simulacije molekularne dinamike so računalniško podprte simulacije, ki nam dajo boljši vpogled v strukturne in dinamične lastnosti (bio)molekularnih sistemov in procesov. Martinijev model, ki je bil razvit s strani Marrink et al. je eden izmed najpogosteje uporabljenih grobozrnatih modelov zaradi svojega enostavnega načela, ki združi skupek atomov v večjo enoto, pri čemer se zmanjša število prostostnih stopenj. Martini polje sil kot gradnike uporablja kroglice (ang. »beads«), ki združi dva ali tri atome v eno kroglico. Glavni cilj te naloge je bil ugotoviti, kako molekulska masa in stopnja razvejanosti vplivata na lastnosti polietileniminov in njihovo vezavo na siRNA. Uporabljeni so bili polietilenimini z molekulsko maso 1,3 kDa, 5 kDa, 10 kDa in 25 kDa, eksperimente pa smo izvajali v pufru HEPES pri pH 5,4 in 7,4. Najprej je bil izveden test, ki uporablja fluorescentno SYBR Gold barvilo, s katerim smo izmerili odstotek proste siRNA in posledično določili učinkovitost kompleksacije različnih polietileniminov na makro nivoju. Meritve smo izvedli v pufru pri obeh pH nivojih ter pri različnih N/P razmerjih. Ugotovili smo, da je polietilenimin z molekulsko maso 10 kDa imel najboljšo učinkovitost enkapsulacije pri obeh pH vrednostih, polietilenimina z molekulsko maso 1,3 in 5 kDa pa sta imela najslabšo. Splošno je bila učinkovitost enkapsulacije boljša v pufru HEPES s pH 5.4. Razlog za slednje smo pripisali temu, da je pri nižjem pH protoniran večji odstotek aminskih skupin. Nato smo izvedli kislinsko-bazično titracijo polietileniminov v 150 mM raztopini NaCl. Raztopino smo titrirali z 1 N HCl ter merili vrednost pH z pH metrom. Titracijske krivulje, ki smo jih pridobili z orodjem »Titratable Martini,« smo primerjali z dejanskimi titracijskimi krivuljami, da bi bolje razumeli kislinsko-bazične značilnosti PEI. Iz eksperimentalnih titracijskih krivulj smo izračunali puferske kapacitete pri različnih pH vrednostih in določili vrednosti pKa iz njihovih maksimumov. Vrednosti pKa so se zmanjšale s povečevanjem molekulske mase PEI. Na žalost eksperimentalni rezultati niso bili skladni s tistimi, pridobljenimi z in silico metodami. Razlog temu lahko pripišemo temu, da tehnika »Titratable Martini« zaenkrat še v zgodnji fazi razvoja. Termodinamične podatke o interakciji PEI-siRNA smo pridobili z izotermno titracijsko kalorimetrijo. Ugotovili smo, da moč vezave pada z naraščajočo molekulsko maso, torej polietilenimin z molekulsko maso 1,3 kDa je imel najmočnejšo afiniteto vezave, 25 kDa pa najšibkejšo. Razlog za slednje je verjetno to, da imajo polietilenimini z nižjo molekulsko maso na voljo večji odstotek končnih aminskih skupin in posledično tvorijo s siRNA bolj tesne komplekse. Ugotovili smo tudi, da je proces vezave PEI na siRNA entalpijsko ugoden (ΔH<0). Prav tako je treba omeniti, da smo izmerili entropijsko izgubo za dva polietilenimina z nižjo molekulsko maso. Podatkov za polietilenimin z molekulsko maso 5 kDa ni bilo mogoče izmeriti, a oprijemljivih razlogov za to nismo odkrili. Pripisali bi jih pretečenemu roku uporabe in agregaciji polietilenimina ter posledični tvorbi kompleksov. Prav tako ni bilo mogoče pridobiti termodinamskih podatkov za polietilenimine v pufru HEPES s pH 7,4, kar smo pripisali temu, da je pri tem pH nivoju nabit manjši odstotek amino skupin polietilenimina. Najprej so bili razviti grobozrnati modeli polietileniminov z različno molekulsko maso in stopnjo razvejanosti. Parametrizacija je tako sledila nedavno nadgrajenim poljem sil Martini. Simulacije molekularne dinamike so bile izvedene z uporabo programskega paketa Gromacs. Martini je bil uporabljen za izdelavo grobozrnatega modela polietileniminov z približno 600 Da in različnimi stopnjami razvejanosti. Grobozrnati model in vseatomske simulacije se dobro ujemajo v porazdelitvah dolžin vezi in velikostih kotov. Na koncu smo ustvarili še velike grobozrnate polietilenimine z molekulsko maso 1,3 kDa, 5 kDa, 10 kDa in 25 kDa z uporabo programskega orodja, ki ga je razvil dr. Benjamin Winkeljann. Na koncu smo manjši model polietileniminov kompleksirali s siRNA. Ugotovili smo, da se amino skupine po večini vežejo na fosfatne skupine siRNA. Ugotovili smo, da je pri eksperimentih, izvedenih v tej nalogi, največji vpliv na rezultate imela molekulska masa polietileniminov, stopnja razvejenosti pa ne. Podatki, ki smo jih pridobiti v tej nalogi, bodo v prihodnosti uporabljeni za povezavo z in vitro testi učinkovitosti transfekcije. Za pridobitev boljšega vpogleda v lastnosti polietileniminov bi morali izvesti tudi meritve velikosti kompleksov, njihove porazdelitve velikosti ter zeta potenciala.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: Simulacije molekulske dinamike, Polje sil Martini, grobozrnjanje, dostava siRNA, polietilenimini, izotermna titracijska kalorimetrija, kislinskobazična titracija, polipleksi.
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Leto izida: 2023
• PID: 20.500.12556/RUL-143909
• Datum objave v RUL: 19.01.2023

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Coarse-grained molecular dynamics simulations to study the complexation of different polyethyleneimines with small interfering RNA

Izvleček

Polyethyleneimines (PEIs) are a group of linear or branched polymers, comprising primary, secondary, and tertiary amines in their repeating unit. PEI has become the gold standard for polymeric RNA delivery systems and therefore frequently serves as a reference for developing novel formulations. The main goal of this thesis was to obtain a more in-depth physical understanding of PEI-siRNA complexation that goes beyond the frequently published empirical approaches. In this study, it was investigated how the molecular weight and the degree of branching affect the properties of polyethyleneimines and their binding to the siRNA. PEIs with a molecular weight of 1.3 kDa, 5 kDa, 10 kDa, and 25 kDa were used. The experiments were performed in HEPES buffer with endo-lysosomal (5.4) and cytosolic (7.4) pH level. First, SYBR Gold assay was performed on polyplexes created from siRNA and investigated PEIs. Their encapsulation efficiencies were determined and compared. The encapsulation efficiency was generally better in HEPES with the pH 5.4. The 10 kDa generally had the best encapsulation efficiency, whereas the 1.3 and the 5 kDa PEI had the worst. Titratable Martini curves were produced and compared to actual titration curves to gain further understanding of the acid-base characteristics of PEI. From the experimental titration curves, buffer capacities at different pH levels were calculated and the pKa values were determined from their maxima. The pKa values decreased as the MW of the PEI increased. Some discrepancies however remained when comparing the experimental results with the ones obtained with Titratable Martini. Thermodynamic data was acquired using isothermal titration calorimetry. It was observed that the binding affinity decreases with increasing molecular weight of the PEI. The thermodynamic parameters will be compared with the parameters extracted from the simulated PEI-siRNA binding in the future. The process of PEI-siRNA binding was also revealed to be enthalpically favoured (ΔH<0). It is also worth noting that entropic loss was recorded for two lower MW PEIs. Coarse-grained models of PEIs with different molecular weight and degree of branching were developed. The parametrisation thereby followed the recently upgraded Martini forcefield. Molecular dynamics simulations were performed using the software package Gromacs. The Martini approach was used to build the coarse-grained model, which is built on four ~600 Da PEIs with four distinct degrees of branching at two different protonation states. The coarse-grained model agrees well on local features such as the distributions of bonded interactions with the corresponding all atom model. In the end, large PEI models with a molecular weight of 1.3 kDa, 5 kDa, 10 kDa, and 25 kDa were generated and coarse-grained using a software tool developed by collaboration partner from the University of Augsburg.

• Ključne besede: Molecular dynamics simulations, Martini forcefield, coarse-graining, siRNA delivery, polyethyleneimines, isothermal titration calorimetry, acid-base titration, polyplexes.