Vrednotenje vsebnosti fosfatov in aminov v bakterijskem peptidoglikanu po različnih postopkih čiščenja in označevanje peptidoglikana

Ristić, Slađana (avtor), Mravljak, Janez (mentor)

Peptidoglikan predstavlja ključno komponento bakterijske celične stene in se nahaja skoraj v vseh bakterijah. Sodeluje v številnih življenjsko pomembnih celičnih procesih za mikroorganizem in ima tudi pomembno zaščitno vlogo. Številni encimi, ki sodelujejo v biosintezi in razgradnji peptidoglikana predstavljajo pomembno tarčo v razvoju antibiotikov, ki lahko z zaviranjem teh encimov povzročijo lizo bakterijske celice. Namen magistrske naloge je bil ovrednotiti peptidoglikan z vidika vsebnosti fosfata, ki sovpada z vsebnostjo tehojske kisline in prostih aminskih skupin, ki pa odražajo poškodbe na peptidoglikanu. Vzorce peptidoglikana, ki smo jih vrednotili, so izolirali iz treh različnih sevov bakterij (S. aureus, B. subtilis, ΔSagB S. aureus) in nato liofilizirali, mi pa smo jih tretirali oz. očistili pod različnimi pogoji. Vsebnost fosfatov smo določali s priročnim enostopenjskim reagentom za določanje prostih fosfatov – reagentom BIOMOL® GREEN. Proste aminske skupine pa smo detektirali s pomočjo ninhidrinske reakcije. Testirali smo dve seriji vzorcev peptidoglikana. Po vrednotenju prve serije vzorcev smo ugotovili, da tisti, ki so bili tretirani s HF, vsebujejo najmanj fosfatov in prostih aminskih skupin. Tako so v drugi seriji vzorcev vse očistili s HF; razlika med njimi je bila v času tretiranja. Pri vzorcih, ki so jih tretirali 24 h, smo ugotovili najmanjše poškodbe peptidoglikana. V drugem delu eksperimentalnega dela smo se lotili označevanja peptidoglikana s fluorescenčno sondo (barvilom). Za označevanje smo izbrali najprimernejši peptidoglikan, tj. peptidoglikan z najnižjo vsebnostjo fosfatnih skupin in prostih aminskih skupin obenem. Označeni peptidoglikan je namreč substrat za encimski test na osnovi fluorescenčne detekcije, s katerim vrednotimo kinetiko izbranih encimov, ki razgrajujejo peptidoglikan. Najvišjo aktivnost smo določili pri encimu AtlA-gl, saj je najuspešneje cepil naš substrat. Pri ostalih dveh encimih (AtlE in SagB) je bila aktivnost komaj zaznavna. Spoznanje, da je najoptimalnejša metoda za čiščenje peptidoglikana 24 h tretiranje s HF, predstavlja pomembno izhodišče za pripravo vzorcev peptidoglikana, ki bi jih želeli v prihodnosti uporabiti za merjenje aktivnosti različnih encimov, ki sodelujejo v biosintezi oz. razgrajevanju te življenjsko pomembne komponente bakterijske celične stene.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: peptidoglikan, biosintezna pot peptidoglikana, tehojske kisline, označevanje peptidoglikana
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Leto izida: 2020
• PID: 20.500.12556/RUL-117208
• Datum objave v RUL: 02.07.2020

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Evaluation of phosphate and amine content in bacterial peptidoglycan following various purification procedures and labeling of peptidoglycan

Izvleček

Peptidoglycan is a key component of bacterial cell wall and is found in almost all bacteria. It is involved in many important cellular processes for the microorganism and also has an important protective role. Many enzymes that are involved in biosynthesis and in the degradation of peptidoglycan represent an important target in the development of antibiotics, which can induce bacterial cell lysis by inhibiting these enzymes. The following Master’s thesis was written with the intent of evaluating peptidoglycan in terms of phosphate content, which coincides with the content of teichoic acid and free amine groups, which reflect damage on the peptidoglycan. Evaluated peptidoglycan samples were isolated from three different bacterial strains (S. aureus, B. subtilis, ΔSagB S. aureus), then lyophilized, treated and cleaned under different conditions. Phosphate content was determined with a convenient one-step reagent for the determination of free phosphates - BIOMOL® GREEN. The free amine groups were detected by a ninhydrin reaction. Two series of peptidoglycan samples were tested. After evaluation of the first series of samples, we found that those treated with HF contained the least phosphate and free amine groups. Thus, in the second series of samples, all were purified with HF; the difference among them was the length of treatment. Minimal peptidoglycan damage was found in samples treated for 24 h. In the second part of the experimental work, we began to label the peptidoglycan with a fluorescent probe (dye). We selected the most suitable peptidoglycan, i.e. peptidoglycan with the lowest content of phosphate groups and free amine groups for labelling. Labeled peptidoglycan is a substrate for an enzyme test based on fluorescence detection, which evaluates the kinetics of selected enzymes that degrade peptidoglycan. The highest activity was determined for the enzyme AtlA-gl, as it cleaved the substrate most successfully. For the other two enzymes (AtlE and SagB), the activity was barely detectable. The finding that the most optimal method of peptidoglycan purification for 24 h is HF treatment, represents an important basis for the preparation of peptidoglycan samples, which we would like to use in the future to measure the activity of various enzymes involved in biosynthesis or process of decomposition of this vital component of the bacterial cell wall.

• Ključne besede: peptidoglycan, peptidoglycan biosynthesis pathway, teichoic acids, peptidoglycan labeling