Depresija je klinično precej heterogena duševna motnja, ki vpliva tako na duševno kot telesno zdravje. Zdravi se lahko s farmakološkimi, biološkimi ali psihoterapevtskimi pristopi. Če bolnik ne doseže ustreznega odziva na zdravljenje z vsaj dvema antidepresivoma, lahko rečemo, da je pri njem prisotna na zdravljenje rezistentna depresija (angl. treatment resistant depression, TRD). Obstajajo različne strategije zdravljenja TRD, ena izmed alternativ je na primer repetitivna transkranialna magnetna stimulacija (rTMS).
Študije na družinah, dvojčkih in posvojencih so pokazale na možno vlogo genetskih dejavnikov pri depresiji. Geni, ki kodirajo možganski nevrotrofni dejavnik (angl. brain-derived neurotrophic factor, BDNF), katehol-O-metiltransferazo (angl. catechol-O-methyltransferase, СОМТ) ter serotoninski prenašalec (angl. solute carrier family 6 member 4, SLC6A4) so geni, ki so zelo zanimivi za raziskave zaradi njihove povezanosti z različnimi duševnimi motnjami. Nekatere študije kažejo povezavo med znižanim izražanjem genov BDNF ter 5-HTT in depresijo. Metilacija DNA je epigenetska sprememba, ki vpliva na izražanje genov. Hipermetilacija DNA je povezana z genskim utišanjem in je bila v središču pozornosti raziskav epigenetskih sprememb, kjer je bila ugotovljena možna povezanost z različnimi boleznimi, tudi z depresijo. Povezave med metilacijo COMT in psihiatričnimi motnjami niso zanesljive, medtem ko je bila povezava med metilacijo genov BDNF ter SLC6A4 in depresijo že večkrat podprta. Vseeno so si rezultati pogosto nasprotujoči.
Prosta cirkulirajoča DNA (angl. cell-free DNA, cfDNA) je prisotna v različnih telesnih tekočinah. Višje ravni cfDNA so pogosto povezane z različnimi boleznimi, na primer z rakom, kjer je cfDNA uporabna kot klinični biomarker za različne tumorje. Analiza ravni cfDNA v telesnih tekočinah pri osebah z depresijo še ni bila opravljena.
Eksperimentalni del magistrske naloge je bil sestavljen iz dveh delov: priprava knjižnice oz. amplikonov za izbrane CpG-otoke treh kandidatnih genov, BDNF, COMT in SLC6A4, ter izolacija in kvantifikacija cfDNA. V raziskavo smo vključili šest bolnikov s TRD, ki so bili vključeni v zdravljenje z rTMS in kontrolno skupino, ki je predstavljala dvajset bolnikov z depresivno motnjo. Bolniki, vključeni v raziskavo, so bili stari med 18 in 70 let, moški in ženske. Bolniki so bili razdeljeni v dve skupini. V prvo skupino so bile vključene osebe med 31 in 63 let (2 moška in 4 ženske) s potrjeno diagnozo TRD. V drugi skupini je bilo 20 bolnikov, starih med 37 in 67 let (7 moških in 13 žensk) z diagnosticirano depresijo. Pri prvi skupini je bilo izvedeno rTMS-zdravljenje. Venska kri je bila odvzeta prvi skupini pred in po rTMS-zdravljenju, ter enkrat v drugi skupini, ki se ni zdravila. Iz venske krvi smo najprej izolirali genomsko DNA in jo obdelali z natrijevim bisulfitom, čemer je sledila verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction, PCR). Opravljena je bila optimizacija za 15 različnih amplikonov. Z optimizacijo smo določili temperaturo prileganja za vsak par začetnih oligonukleotidov vključenih v poskus. Po optimizaciji smo vsak amplikon pomnožili na vseh vzorcih in uspešnost pomnoževanja potrdili z elektroforezo na agaroznem gelu. Nato smo vsak amplikon očistili po protokolu, ki je vključeval uporabo paramagnetnih kroglic. S fluorescenčno metodo smo določili koncentracijo produktov PCR in nato vseh 15 amplikonov za vsakega bolnika ekvimolarno združili v eno mikrocentrifugirko. Nato je sledila druga reakcija PCR, s katero smo vse amplikone posameznega bolnika označili z unikatnimi indeksi, ki so omogočili ločevanje med bolniki pri analizi rezultatov sekvenciranja. Uspešnost drugega kroga PCR smo preverili z elektroforezo na agaroznem gelu. Sledilo je čiščenje indeksiranih amplikonov, ekvimolarno združevanje vseh amplikonov v skupno knjižnico in sekvenciranje naslednje generacije (angl. next generation sequencing, NGS), ki nam je omogočilo določanje stopnje metilacije vseh ampikonov. Bioinformatska in statistična obdelava rezultatov je bila opravljena s programi FastQC, TrimGalore, Bismark in R (methylKit, annotatr). Tako so bile opravljene tri primerjave metilacije: primerjava metilacije med kontrolno skupino in skupino bolnikov, ki so ji diagnosticirali TRD, pred zdravljenjem z rTMS; med kontrolno skupino in skupino bolnikov, ki so ji diagnosticirali TRD, po zdravljenju z rTMS; primerjava metilacije pri bolnikih z diagnozo TRD, pred in po zdravljenju z rTMS. Z uporabo tehnologije NGS smo v izbranih CpG-otokih določili število metiliranih in nemetiliranih citozinov in s tem stopnjo metilacije, pri čemer smo za mejo statistične značilnosti postavili vrednost q<0,05. Rezultati vseh treh primerjav niso pokazali statistično pomembnih razlik v stopnji povprečne metilacije amplikonov med primerjanimi skupinami.
Uspešnost izolacije cfDNA smo potrdili na bioanalizatorju, ki deluje na osnovi kapilarne elektroforeze. Opazili smo fragmente DNA, dolge približno 200 baznih parov, in tako smo lahko izključili možnost izolacije genomske DNA. Kvantifikacija cfDNA je bila izvedena z uporabo kapljičnega digitalnega PCR (angl. digital droplet PCR, ddPCR), ki omogoča natančno kvantifikacijo majhnih količin DNA. Za analizo smo uporabili Studentov t-test, ki nam je omogočil primerjavo količine cfDNA pri bolnikih z diagnozo TRD pred in po zdravljenju z rTMS. Tako je bila potrjena ničelna hipoteza, da se povprečna koncentracija cfDNA pri bolnikih, ki so bili zdravljeni z rTMS, pred in po zdravljenju ni statistično pomembno razlikovala.
Na podlagi pridobljenih rezultatov lahko pridemo do različnih zaključkov. Lahko rTMS-zdravljenje ni bilo uspešno za TRD, ali pa preiskovane skupine niso dovolj natančno opredeljene in dovolj velike, saj smo želeli opraviti le eksploratorno študijo. Čeprav naši rezultati metilacije za BDNF, SLC6A4 in COMT nasprotujejo nekaterim ugotovitvam v strokovni literaturi, je to lahko posledica različnih analiznih metod ali razlik v kohorti, pa tudi števila preiskovancev, vključenih v raziskavo. Poleg tega ima razlika v starosti in spolu bolnikov lahko pomemben vpliv. Bolniki, ki so bili vključeni v raziskavo, so bolniki, ki jim je bila diagnosticirana TRD, brez unipolarne depresije in brez psihotičnih simptomov, brez drugih vrst psihoz ter so bili rezistentni na zdravljenje z antidepresivi. Tako hipoteze, da sta raven metilacije treh kandidatnih genov in koncentracija cfDNA v plazmi pri bolnikih z diagnozo TRD spremenjena pred in po zdravljenju s rTMS, nismo uspeli potrditi. V prihodnosti bi morali izvesti študijo z večjim številom bolnikov, ki bi morda dodale nov pogled na naše preliminarne rezultate.
|
