Vpeljava metode določitve mutacij W515L in W515K v receptorju za trombopoetin,z načinom verižne reakcije s polimerazo v realnem času, pri bolnikih z esencialno trombocitemijo : diplomska naloga

Kovačič, Leonida (author), Mlakar, Uroš (mentor), Pajič, Tadej (comentor)

Pri večini bolnikov s policitemijo vera (PV) in pri približno polovici bolnikov z esencialno trombocitemijo (ET) in primarno mielofibrozo (PM) lahko dokažemo pridobljeno somatsko mutacijo JAK2 V617F. Nadaljnje raziskave so pokazale, da v približno 1-9 % bolnikov z ET in v 5-11 % bolnikov s PM ugotovimo somatske mutacije v genu za trombopoetinski receptor MPL. Slednje se pri drugih mieloproliferativnih novotvorbah (MPN) pojavijo redko. Določitev mutacije JAK2 V617F in mutacij v genu MPL sta pomembni dodatni preiskavi pri postavitvi diagnoze mieloproliferativnih novotvorb. Zamenjavi aminokisline triptofan za levcin (MPL W515L) in lizin (MPL W515K) na mestu 515 aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin sta najpogosteje ugotovljeni pridobljeni mutaciji trombopoetinskega receptorja pri bolnikih z ET in PM. Mutaciji najverjetneje povzročata, da je beljakovina aktivna brez vezanega liganda. Namen našega dela je bil vpeljava metode določitve mutacij MPL W515L/K v receptorju za trombopoetin, z načinom verižne reakcije s polimerazo v realnem času (uporaba reagenčnega kompleta MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija)) in določitev deleža bolnikov z ET, ki so imeli mutaciji MPL W515L/K. Oblikovali smo delovni hipotezi in sicer, da reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija) omogoča določitev mutacij MPL W515L/K in da se mutaciji MPL W515L/K pojavljata pri 1-9 % bolnikov z ET.Da bi hipotezi dokazali smo iz vzorcev venske krvi 77 bolnikov z ET izolirali granulocite z gradientnim centrifugiranjem preko fikola. Iz granulocitov smo izolirali celokupno DNA in ji spektrofotometrično izmerili koncentracijo ter čistočo. Prisotnost mutacij MPL W515L/K smo nato določili s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qPCR) in alelno diskriminacijo.Prisotnost mutacije MPL W515L/K smo dokazali pri štirih (5 %) bolnikih z ET, kar je v skladu s podatki iz literature. Ugotovili smo tudi, da je mutacija MPL W515L pogostejša, saj smo jo dokazali pri treh (4 %) bolnikih z ET. Mutacijo MPL W515K smo dokazali pri enem (2 %) bolniku. Reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija) omogoča določanje mutacij MPL W515L/K.

• Language: Slovenian
• Keywords: esencialna trombocitemija izolacija granulocitov verižna reakcija mutacije v genu MPL alelna diskriminacija
• Work type: Undergraduate thesis
• Typology: 2.11 - Undergraduate Thesis
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Place of publishing: Ljubljana
• Publisher: [L. Kovačič]
• Year: 2011
• Number of pages: VI, 48 f.
• PID: 20.500.12556/RUL-71132
• UDC: 616-074
• COBISS.SI-ID: 2949233
• Publication date in RUL: 10.07.2015

Secondary language

• Language: English
• Title: The thrombopoietin receptor W515L abd W515K mutation detection by real time polymerase chain reaction in essential thrombocytemia patients