Optimizacija postopka priprave SUCB iz celične linije HEK293 z vključkom za človeški protein BCMA in NF-kB-luciferazni reporter

Petrovčič, Rahela (author), Župunski, Vera (mentor)

Z magistrsko nalogo smo si zastavili raziskovalne cilje in delovne hipoteze, ki usmerjajo optimizacijo priprave celične banke za enkratno uporabo (SUCB) iz gensko spremenjene celične linije HEK293 BCMA. Prvi cilj je bil izboljšati postopek priprave SUCB z doseganjem visoke viabilnosti celic ob odmrzovanju, ustrezne koncentracije živih celic v krioviali ob zamrzovanju (≥ 1 × 10⁷ celic/mL) ter potrditvijo funkcionalnosti v bioanalitičnem testu. Drugi cilj je vključeval identifikacijo genetskih in transkriptomskih dejavnikov, ki so zaznani ob nizki viabilnosti in počasni rasti celic. Tretji cilj pa je bil primerjati ročno štetje celic s hemocitometrom in avtomatizirano štetje z analizatorjem Vi-cell XR z namenom poenostavitve analitskih postopkov. Na podlagi teh ciljev smo oblikovali sledeče hipoteze: • pripravo SUCB je mogoče optimizirati za doseganje vseh funkcionalnih in kakovostnih kriterijev, • genetske razlike med “dobrimi” (tj. celična banka gojena pri optimalnih pogojih) in “slabimi” (tj. celična banka gojena pri suboptimalnih pogojih) celičnimi bankami so povezane z regulacijo apoptoze, • med metodama štetja celic ni statistično pomembnih razlik. V teoretičnem ozadju smo izpostavili pomembnost celične linije HEK293, ki zaradi svoje transficibilnosti in robustnosti predstavlja standard v bioanalitiki. V našem raziskovalnem delu je bila uporabljena različica, ki izraža receptor BCMA in luciferazni reporter pod nadzorom NF-κB signalne poti. BCMA je ključni regulator preživetja plazemskih celic, njegova aktivacija preko ligandov BAFF in APRIL pa sproži transkripcijo genov, povezanih z imunskim odzivom. Uporaba luciferaznega reporterskega sistema nam je omogočila kvantifikacijo funkcionalnosti celične banke, kar je ključno pri potrditvi uporabe SUCB za bioanalitično testiranje. Kot izboljšava klasične priprave celičnih bank se v zadnjem času uveljavlja SUCB, ki omogoča takojšnjo uporabo celic brez dodatnih kultivacijskih korakov po odmrzovanju. To bistveno poveča ponovljivost in učinkovitost bioanalitičnih postopkov ter zmanjša tveganje mikrobiološke kontaminacije. Kljub prednostim priprava SUCB vključuje več izzivov, kot so optimizacija krioprezervacijskih pogojev, zagotavljanje konsistentnosti med serijami in preprečevanje toksičnosti DMSO. Pri eksperimentalnem delu smo uporabili širok nabor laboratorijske opreme, med drugim kriobanke, inkubatorje, mikroskop, analizator Vi-cell XR ter sekvenator NextSeq 1000. Uporabili smo standardizirane medije za odmrzovanje, kultivacijo, zamrzovanje in bioanalitične teste, pripravljene iz DMEM osnovnega medija z dodatki: FBS, natrijev piruvat, antibiotika blasticidin in higromicin B ter DMSO v vlogi krioprotektanta. Eksperimentalni pristop je temeljil na načrtovanju eksperimentov (DOE) z uporabo programa JMP. V prvem eksperimentu smo optimizirali parametre rasti, kot so delovni volumen, temperatura medija, dolžina pasaže, nacepitvena koncentracija in tip kultivacije. V drugem eksperimentu smo analizirali parametre zamrzovanja in odmrzovanja vključno s koncentracijo DMSO, časom izpostavljenosti DMSO, načinom odmrzovanja in temperaturo gojišča. Postopki kultivacije so vključevali standardizirano precepljanje adherentnih celic z uporabo akutaze, centrifugiranje in precepljanje v plastenke za gojenje celic (ang. T-flask) različnih velikosti. Zamrzovanje je potekalo s kontroliranim hlajenjem v vsebnikih Mr.Frosty, pri čemer je bila uporabljena koncentracija DMSO glede na eksperimentalni načrt. Odmrzovanje smo izvedli bodisi v vodni kopeli bodisi v termostresalniku, čemur je sledilo centrifugiranje in ponovna suspenzija v mediju. Za štetje celic in določanje viabilnosti smo uporabili dve napravi: ročni hemocitometer z barvilom Trypan Blue in avtomatizirani analizator Vi-cell XR. Oba sistema omogočata kvantifikacijo koncentracije živih celic in viabilnosti. Meritve so bile uporabljene za nadaljnjo statistično analizo. Za genomsko analizo smo pripravili knjižnice RNA iz vzorcev “dobrih” in “slabih” celičnih bank. Vzorci obeh bank so bili zbrani pred zamrzovanjem, takoj po odtaljevanju in 24 h po odtaljevanju bank. RNA smo izolirali, kvantificirali in obdelali z kompletom Illumina Ribo-Zero Plus. Sekvenciranje je potekalo na sistemu NextSeq, rezultate smo analizirali z orodji za diferencialno izražanje in obogatitev funkcionalnih kategorij (GO enrichment analysis). V sklopu mikrobiološkega testiranja SUCB smo izvedli test sterilnosti in preverjanje prisotnosti mikoplazem. Funkcionalnost SUCB smo potrdili z bioanalitičnim testom, ki temelji na luciferaznem odzivu na vezavo APRIL in simuliranega vzorca. V nadaljevanju smo podrobno analizirali rezultate dveh načrtovanih eksperimentov (DOE), primerjave metod štetja celic ter genomske analize celičnih bank. S prvim eksperimentom smo se osredotočili na optimizacijo parametrov rasti celične kulture. Analiza 30 eksperimentalnih ponovitev je pokazala, da nižji delovni volumen (WV) negativno vpliva na rast celic, kar je lahko povezano s hitro izčrpanostjo hranil in kopičenjem toksičnih metabolitov. Tip kultivacije L2 (4-dnevne pasaže z nižjo nacepitveno koncentracijo) je povezan z daljšim časom podvojitve populacije (PDT), nižjo viabilnostjo po odmrzovanju in zmanjšano celično rastjo v prvih 24 urah po odmrzovanju. Visoka nacepitvena koncentracija v zadnji pasaži je povzročila prekomerno zasedenost površine za rast, kar je vodilo v nižje koncentracije živih celic in viabilnosti ob koncu pasaže. Optimalni pogoji kultivacije celic pred zamrzovanjem so bili določeni kot: 1,5 × delovnega volumna pred optimizacijo, predogreto gojišče, tip kultivacije L1 (3-dnevne pasaže), nacepitvena koncentracija v zadnji pasaži 0,084 × 10⁶ celic/mL in dolžina zadnje pasaže 2 dni. Z drugim eksperimentom smo obravnavali parametre zamrzovanja in odmrzovanja. Rezultati so pokazali, da je optimalna koncentracija DMSO 5 % s 30-minutno izpostavljenostjo pred zamrzovanjem, kar je minimalen časovni okvir, ki še omogoča pripravo SUCB primerne velikosti za uporabo v rutinskem testiranju. Daljša izpostavljenost ali višja koncentracija DMSO sta povzročili toksične učinke in zmanjšano celično rast po odmrzovanju. Način odmrzovanja v termomikserju je pokazal rahlo boljše rezultate kot odmrzovanje v vodni kopeli, vendar smo zaradi rutinsko vpeljane uporabe vodne kopeli ohranili slednje. Temperatura gojišča ob odmrzovanju je imela U-oblikovan vpliv: predogreto gojišče (35–37 °C) je omogočilo najhitrejšo rast, medtem ko je bila viabilnost najvišja pri uporabi gojišča sobne temperature. Z analizo smo potrdili, da je kombinacija nizke koncentracije DMSO, kratke izpostavljenosti DMSO in predogretega gojišča pri odmrzovanju ključna za ohranjanje funkcionalnosti SUCB. Primerjava metod štetja celic med hemocitometrom in Vi-cell XR je pokazala statistično pomembne razlike med napravama. Pri uporabi hemocitometra so bile meritve koncentracije živih celic nekoliko nižje, meritve viabilnosti pa nekoliko višje kot pri Vi-cell XR. Korelacija med metodama je bila visoka (Pearson r > 0,95 za koncentracijo živih celic), vendar so bile razlike dovolj velike, da metode niso zamenljive brez kalibracije oz. dodatne nastavitve z uporabo regresijske enačbe kot korekcijskega faktorja. Analiza Bland-Altman je potrdila sistematični odklon, kar zavrača hipotezo o statistični nepomembnosti razlik med metodama. Genomsko analizo smo izvedli na “dobri” (GB) in “slabi” (BB) celični banki. Diferencialna ekspresija genov je pokazala, da so pri BB povečano izraženi geni povezani z aktivacijo poti povezanih z endoplazmatskim stresom (ER stress), odzivom na nepravilno zvite proteine in aktivacijo UPR (unfolded protein response). Te poti vodijo v apoptozo, kar je skladno z nižjo viabilnostjo in rastjo BB. Nasprotno pa je GB pokazala povečano izražanje genov, povezanih z regulacijo miRNA, razvojem tkiv in odpornostjo na stres, kar bi lahko nakazovalo na razlog za boljšo kakovost SUCB. Z analizo GO (Gene Ontology) smo potrdili statistično pomembno obogatitev bioloških procesov, povezanih z diferenciacijo, proliferacijo in epigenetsko regulacijo. Za optimizirano pripravo SUCB smo uporabili optimizirane parametre iz obeh sklopov eksperimentov. Pripravljena banka je vsebovala 92 vial z viabilnostjo nad 91 % in koncentracijo ≥ 1,0 × 10⁷ živih celic/mL. Z mikrobiološkim testiranjem smo potrdili sterilnost in odsotnost mikoplazem, medtem ko je bioanalitični test z luciferaznim reporterjem potrdil funkcionalnost SUCB v odzivu na simuliran vzorec. Tako smo izpolnili vse zahteve in v celoti potrdili prvo hipotezo. Zaključek magistrske naloge potrjuje, da smo optimizacija postopka priprave celične banke za enkratno uporabo iz gensko modificirane celične linije HEK293 BCMA uspešno izvedli. Z uporabo sistematičnega pristopa, temelječega na načrtovanju eksperimentov (DOE), smo identificirali in prilagodili ključne parametre, ki vplivajo na rast, viabilnost in funkcionalnost celic. Rezultati potrjujejo, da je SUCB, pripravljena pod optimiziranimi pogoji, dosegla vse zastavljene kriterije kakovosti: visoko viabilnost (> 91 %), ustrezno koncentracijo živih celic (≥ 1,0 × 10⁷ živih celic/mL), sterilnost, odsotnost mikoplazem in potrjeno funkcionalnost na bioanalitičnem testu. Z genomsko analizo smo dodatno osvetlili molekularne mehanizme, ki so povezani s kakovostjo celičnih bank. Primerjava metod štetja celic je pokazala statistično pomembne razlike med hemocitometrom in analizatorjem Vi-cell XR. Čeprav obe metodi temeljita na uporabi barvila Trypan Blue, se razlikujeta v natančnosti, ponovljivosti in izkušenosti uporabnika. Uporaba obeh metod za namen določanja koncentracije živih celic in viabilnosti je primerna, za njuno medsebojno zamenljivost pa je potrebna korekcija. Z magistrsko nalogo smo pokazali, da je z uporabo podatkovno podprtega pristopa mogoče bistveno izboljšati kakovost SUCB in s tem povečati zanesljivost bioanalitičnih testov. Rezultati prispevajo k širšemu razumevanju produkcije celičnih bank, optimizacije kultivacijskih postopkov in molekularnih mehanizmov, ki vplivajo na funkcionalnost celičnih linij. Predlagane smernice in ugotovitve predstavljajo trdno osnovo za nadaljnje raziskave na področju biofarmacevtske proizvodnje in analitike.

• Language: Slovenian
• Keywords: celična banka za enkratno uporabo (SUCB), celična linija HEK293 BCMA, načrtovanje eksperimentov (DOE), optimizacija krioprezervacije, genomska analiza
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FKKT - Faculty of Chemistry and Chemical Technology
• Year: 2025
• PID: 20.500.12556/RUL-177285
• Publication date in RUL: 19.12.2025

Secondary language

• Language: English
• Title: Optimisation of the SUCB preparation process from the HEK293 cell line with an insert for the human BCMA protein and NF-kB-luciferase reporter

Abstract

This master's thesis presents a comprehensive optimisation of the single-use cell bank (SUCB) preparation process from a genetically modified HEK293 cell line expressing the human B-cell maturation antigen (BCMA) and an NF-κB-luciferase reporter. The aim of the study was to improve the cell viability, growth rate, and functional performance of SUCBs used in bioassays, while also evaluating alternative cell counting methodologies. Using a two-phase design of experiments (DOE) approach, key parameters influencing cell culture performance were identified and optimised. The first DOE experiment focused on cultivation conditions, revealing that lower working volumes, extended passage durations, and high viable cell concentrations negatively impacted cell viability and proliferation. The second DOE experiment refined freezing and thawing parameters, establishing that 5 % DMSO with a 30-minute exposure time and preheated thawing medium yielded optimal results. A comparative analysis between a haemocytometer and the Vi-Cell XR revealed statistically significant differences in cell concentration and viability measurements, highlighting the need for standardisation across analytical platforms. The genomic profiling of optimal and suboptimal cell banks revealed differential expression patterns linked to ER stress and apoptosis in suboptimal conditions, while optimal conditions promoted miRNA regulation and stress resilience. The optimised SUCB met all predefined criteria, including high viability (> 91 %), target viable cell concentration (≥ 1 × 10⁷ viable cells/mL), sterility, and confirmed functionality in luciferase-based bioassays. These findings contribute to improved reproducibility and efficiency in bioanalytical workflows, and offer insights into the molecular mechanisms underlying cell bank quality.

• Keywords: single-use cell bank (SUCB), HEK293 BCMA cell line, design of experiments (DOE), cryopreservation optimisation, genomic analysis