Biofarmacevtski izdelki, znani tudi kot biološka zdravila, so razred farmacevtskih izdelkov, ki zajemajo vse biološke izdelke, ki jih proizvajajo živi organizmi ali so proizvedeni iz njih z uporabo tehnologije rekombinantne DNA, vključno z rekombinantnimi proteini, cepivi ter preparati za celične in genske terapije. V zadnjih petih letih se je odstotek bioloških zdravil med novimi zdravili, ki jih je odobrila ameriška Uprava za hrano in zdravila (FDA), gibal med 36 in 50 %. Med biološkimi zdravili prevladujejo monoklonska protitelesa (mAb); zanje je povprečna napoved vrednosti prodaje 1 milijarda dolarjev letno.
Sesalske celične linije so prednostni ekspresijski sistem za rekombinantne terapevtske proteine, saj so potrebne specifične posttranslacijske modifikacije, ki se pojavljajo le v sesalskih celicah. Najpogosteje uporabljamo celične linije, ki izvirajo iz celic jajčnikov kitajskega hrčka (angl. Chinese hamster ovary, CHO). Prednost te linije je med drugim možnost gojenja v suspenzijski kulturi, kar omogoča uporabo reaktorjev oziroma bioreaktorjev, ki omogočajo proizvodnjo proteinov v velikih volumnih, tudi do 10.000 L
Bioreaktorji so specializirane posode ali sistemi, ki ustvarjajo nadzorovano okolje za biološke reakcije ali procese, pogosto z živimi organizmi ali biološkimi agensi. Za gojenje sesalskih celic omogočajo natančno regulacijo ključnih parametrov, kot so temperatura, pH, raztopljeni kisik, raven hranil in hitrost mešanja, kar pomaga optimizirati rast, metabolizem in proizvodne procese. Pomembno je, da sistem v notranjosti zagotavlja sterilno okolje, kjer se dodatki in plini dodajajo skozi membranske filtre ali sterilizirajo z avtoklaviranjem. Glavne komponente takšnih bioreaktorjev so posoda, mešalni sistem, sistem vzorčenja, sistem pridobivanja podatkov in kontrolni sistemi za uravnavanje temperature, pH, plinov in hranil.
Sesalske celice proizvajajo ATP v procesu glikolize (2 ATP na molekulo glukoze) in oksidativne fosforilacije (36 ATP na molekulo glukoze). V glikolizi nastaja laktat, medtem ko oksidativna fosforilacija poteka v mitohondrijih v ciklu trikarboksilnih kislin (TCA). Celice preklapljajo med oksidativnim in glikolitičnim metabolizmom glede na okolje, v katerem so. Tip metabolizma je odvisen tudi od faze rasti (eksponentna in stacionarna faza ter faza upadanja). V eksponentni fazi celice bujno rastejo na račun glikolize in je proizvodnja rekombinantnega proteina nizka. V stacionarni fazi se laktat začne porabljati in postane metabolizem pretežno oksidativen proizvodnja proteina pa največja. V fazi upada pride do izčrpanja hranil, kar zmanjša glikolizo in aktivnost TCA-cikla, poveča se koncentracija oksidiranega glutationa, kar oslabi obrambo pred reaktivnimi kisikovimi spojinami, kopičijo pa se tudi toksični produkti, kot sta laktat in amonijak, kar vodi v celično smrt in zmanjšano produktivnost.
Proizvodnja bioloških zdravil je večstopenjski biotehnološki proces, ki ga lahko na splošno razdelimo na dve glavni fazi: pripravljalne procese (angl. upstream processing) in zaključne postopke (angl. downstream processing). Pripravljalni procesi obsegajo razvoj celične linije z vnesenim genom, ki kodira želeno biološko zdravilo, in gojenje celic ter hkrati proizvodnjo biološkega zdravila. Vsaka proizvodna serija se začne z odtaljevanjem alikvota celične kulture, čemur sledi gojenje celic s povečevanjem volumna, da dosežemo potrebno gostoto celic in volumen celične kulture, ki predstavlja vcepek za bioreaktor produkcijske faze. V njem poteka proizvodnja biološkega zdravila, čemur sledijo zaključni postopki procesa. Ti se začnejo z žetvijo, kjer odstranimo celice s centrifugiranjem in/ali filtriranjem, in nadaljujejo s fazo čiščenja. Sestavljajo jo različni koraki kromatografij, ki lahko vključujejo afinitetno, ionsko izmenjevalno, kromatografijo z ločevanjem po velikosti, hidrofobno interakcijsko kromatografijo ali kromatografijo z indukcijo hidrofobnega naboja. Temu sledi virusna inaktivacija in filtracija, ki zagotovi terapevtsko varnost z odstranitvijo morebitnih virusnih kontaminacij. Zadnji korak je formuliranje prečiščenega biološkega zdravila z ustreznimi pufri za zagotovitev ustreznih pogojev shranjevanja in pakiranje izdelka v sterilne vsebnike za klinično uporabo. Obstajajo različni načini izvedbe proizvodne faze, ki so na splošno razdeljeni na šaržne in kontinuirne procese. Pri šaržnem procesu vse surovine, kot so gojišče, celice in dodatki, dodamo na začetku procesa, produkt pa kasneje naenkrat odstranimo. Pri neprekinjenem procesu pa materiale dodajamo v sistem in produkt izločamo iz sistema skozi celoten proces.
Za učinkovito in stroškovno ugodno podporo razvoju, optimizaciji in odpravljanju težav pri procesih, mora imeti vsak proizvodni proces še model procesa v manjšem laboratorijskem obsegu, znan kot »model v zmanjšanem obsegu« (angl. Scale-Down Model, SDM). Za SDM-je je ključno, da kažejo enakovrednost kritičnih atributov kakovosti in se podobno odzivajo na spremembe parametrov procesa kot proces v proizvodnem obsegu.
Namen dela in hipoteze
V sklopu te magistrske naloge smo želeli raziskati primernost različnih laboratorijskih posod za razvoj SDM-ja komercialnega procesa proizvodnje rekombinantega proteina v proizvodnem obsegu z uporabo celične linije CHO. Cilj je bil ugotoviti, katera posoda najbolje reproducira ključne značilnosti procesa, to so parametri, odvisni in neodvisni od obsega, celična produktivnost ter metabolizem, kar omogoča dosleden in smiselen prenos znanja o procesih z laboratorijskega na proizvodni obseg. Želeli smo primerjati štiri različne laboratorijske posode, in sicer stresalna plastenka (angl. shake flask, SF), SF s prestrezniki (angl. baffled shake flask, BSF) in mešalni plastenki (angl. spinner flask, SpF) dveh velikosti, ki se razlikujejo po geometriji, prostornini, razmerju med prostornino in površino ter zmogljivostih izmenjave plinov. Procese smo primerjali s 5-litrskim mešalnim bioreaktorjem (angl. Stirred Tank Reactor, STR), ki je služil kot referenčni model, saj je najboljši približek procesa v proizvodnem obsegu. Zastavili smo si hipotezo, da so mešalne plastenke najprimernejše za SDM procesa v proizvodnem obsegu.
Poleg tega smo s poznavanjem metabolizma celic CHO in ključnih parametrov, ki so potrebni za gojenje celične kulture CHO za proizvodnjo rekombinantnega proteina, želeli raziskati načine, kako se celice prilagajajo gojenju v neoptimalnih pogojih. Osredotočili smo se na raziskovanje različnih vrednosti pH začetnih gojišč, hipoksičnih pogojev (nizka vsebnost O$_2$) in odsotnosti ogljikovega dioksida (CO$_2$) v gojitveni atmosferi. Zastavili smo si hipotezo, da neoptimalni pogoji negativno vplivajo na rast in produktivnost celic preko vpliva na metabolizem.
Metode
Poskuse smo izvedli s celično linijo CHO, ki se uporablja za šaržni proces proizvodnje rekombinantnega proteina, ki se kontinuirno izraža in izloča v gojišče. Proces smo izvajali v laboratorijskem obsegu v različnih gojitvenih posodah nameščenih v stresalnem inkubatorju, oziroma v 5-litrskih bioreaktorjih STR. Tekom procesa smo izvajali analize na vzorcih celičnih kultur, in sicer na napravah Vi-Cell XR, kjer smo spremljali gostoto živih celic (angl. Viable Cell Density, VCD) in celično živost, ter FLEX2, kjer smo spremljali koncentracije metabolitov (glukoze, laktata, glutamina, glutamata in amonijevega iona), kot tudi pH, pO$_2$ in pCO$_2$. Po koncu procesa smo izvedli žetev in čiščenje rekombinantnega proteina z uporabo afinitetne kromatografije. Izplen izoliranega proteina smo kvantificirali sprektrofotometrično.
Za interpretacijo rezultatov smo izmerjene koncentracije metabolitov izrazili kot porabo oziroma produkcijo metabolita na dan na celico. Prav tako smo rezultate izolacije proteina izrazili kot produkcijo proteina na celico oziroma celično specifično produktivnost.
Zaradi interesov podjetja, kjer sem opravljala magistrsko nalogo, so nekateri podatki, predvsem o rekombinantnem proteinu in sestavi gojišč, tajni. Kljub temu se izvedba in rezultati opisani na način in v obsegu, ki omogoča preverjanje hipotez.
Rezultati in razprava
V prvem delu magistrske naloge smo izvajali šaržni proces proizvodnje rekombinatnega proteina v različnih gojitvenih posodah, to so stresalna plastenka (SF), SF s prestrezniki (BSF), mešalni plastenki (SpF) dveh velikosti (125 mL – SpF in 500 mL – SpF 2) in dve različici 5-litrskih bioreaktorjev STR: za enkratno uporabo (angl. single use, STR SU) in stekleni (STR glass). Rezultati so pokazali, da glede na parametre rasti celic posode lahko razdelimo v tri skupine, za kar sta ključna dejavnika pH in pO$_2$ – v prvo skupino spadata SF in BSF, v drugo SpF in SpF 2 ter v tretjo STR SU in STR glass. pO$_2$ namreč pogojuje celični metabolizem, ki je pri nižji vrednosti bolj glikolitičen kot oksidativen in ravno obratno pri višji vrednosti pO2. Posodi SF-BSF vodita v visoko vrednost pO$_2$, kar je posledica dobre izmenjave plinov, in zato nižjo porabo glukoze in produkcijo laktata ter višji pH. To omogoča dobro rast in produktivnost celic. Nasprotno je imela kultura v posodah SpF in SpF2 nizko vrednost pO$_2$ in zato višjo raven glikolitičnega metabolizma, ki se kaže v višji porabi glukoze in produkciji laktata. To ima za posledico nižji pH in počasnejšo rast. Razlog za to je slaba izmenjava mase in plinov, kar se kaže tudi v visoki produkciji glutamata, ki je pokazatelj oksidativnega stresa. Regulacija pH v STR pa omogoči primerljivo raven glikolitičnega metabolizma celicam v SpF, vendar ohranjanje pH z dodajanjem baze omogoča hitrejšo rast. Iz tega sledi, da je pH omejujoč dejavnik, ki zavira rast.
Zaradi boljše primerjave metabolizma celic v SpF in SpF 2 s STR, smo želeli optimizirati gojenje v SpF in SpF 2. To smo izvedli s povečanjem hitrosti mešanja in dodatnim zračnim filtrom na SpF, ki pripomore k boljši izmenjavi plinov med atmosfero v stresalniku in atmosfero v plastenki. Čeprav je optimizacija delno izboljšala rast in zmanjšala glikolitični metabolizem celic, SpF in SpF 2 ne omogočata primerljivega gojenja s STR glass in zato nista primerni gojitveni posodi za SDM procesa.
V drugem delu magistrske naloge smo raziskovali, kako se celice odzovejo na suboptimalne pogoje, kot so nizek in visok pH, hipoksija in odsotnost CO$_2$ v gojitveni atmosferi. CO$_2$ se je izkazal kot ključni faktor, brez katerega celice umrejo, saj se podre njihov pufrski sistem. V našem primeru odsotnost CO$_2$ ni vodila v višjo produktivnost celic, kot je to bilo opisano v literaturi, celice pri nizkem in visokem pH pa se že v prvem dnevu gojenja prilagodijo z uravnavo glikolize in s tem produkcije laktata, kjer pri nizkem pH proizvedejo manj in pri visokem pH več laktata v primerjavi z referenco pri običajnem pH. S tem si uravnajo pH celične kulture, ki se približa referenčnemu. Po začetni prilagoditvi, celice z visokega začetnega pH rastejo povsem primerljivo z referenco in imajo tudi enak metabolizem tekom gojenja. Nasprotno pa imajo celice z nizkega začetnega pH počasnejšo rast in nižjo viabilnost tekom gojenja. To nakazuje, da jim je uravnavanje pH zmotilo homeostazo, ki jim ne omogoča primerljive rasti z referenco. Najpočasneje pa celice rastejo v hipoksičnih pogojih, kjer le določeno število celic lahko raste, presežek pa odmre. Celice se torej ne prilagodijo na okolje, saj imajo podoben metabolizem referenci, pač pa je rast omogočena le manjšemu številu celic.
Zaključek
Ugotovili smo, da tip gojitvene posode močno vpliva na rast in produktivnost celic CHO. SF so se izkazale kot bolj primerljive s STR kot SpF, zato smo prvo hipotezo ovrgli. Poleg tega so suboptimalni pogoji, kot so nizek pH, hipoksija in odsotnost CO$_2$, negativno vplivali na celice, medtem ko visok pH ni imel vpliva na rast celic. S tem smo delno potrdili drugo hipotezo.
|
