Biokompatibilnost hemodializnih in plazmafereznih postopkov s citratno antikoagulacijo

Orsag, Aleša (author), Gubenšek, Jakob (mentor)

POVZETEK UVOD Hemodializa je ena izmed oblik nadomestnega zdravljenja pri končni ledvični odpovedi, pri kateri poteka izmenjava snovi med krvjo bolnika in dializno raztopino v dializatorju preko polprepustne membrane. Druga zunajtelesna metoda, ki smo jo preučevali, pa je membranska plazmafereza (MPF), ki je ena izmed oblik zdravljenja avtoimunskih in nekaterih drugih s sestavinami plazme povzročenih bolezni. Pri MPF ločimo plazmo od krvnih celic z zelo prepustno membrano, filtrirano plazmo zavržemo in jo nadomestimo z nadomestno tekočino. Pri obeh postopkih je za preprečevanje strjevanja krvi nujno potrebna antikoagulacija, za katero običajno uporabljamo standardni ali nizkomolekularne heparine, ki pa imajo sistemski učinek. Pri bolnikih, pri katerih je sistemska antikoagulacija zaradi aktivne krvavitve, povečanega tveganja zanjo ali neželenih učinkov heparina (s heparinom povzročena trombocitopenija - HIT) kontraindicirana, lahko uporabimo področno antikoagulacijo s citratom (RCA), kjer je antikoagulantni učinek v celoti omejen na zunajtelesni obtok. Podatki iz literature kažejo, da pride pri RCA do manjše interakcije krvi z umetnim materialom kot pri heparinski antikoagulaciji, manj je aktivacije trombocitov, levkocitov in komplementa, kar izboljša biokompatibilnost procedure. Znano je, da je učinek citrata odvisen od odmerka oz. od dosežene stopnje hipokalcemije v zunajtelesnem obtoku. V sklopu doktorske naloge smo opravili dve raziskavi s področja antikoagulacije med zunajtelesnimi postopki. Ker direktne primerjave dveh odmerkov citrata na parametre biokompatibilnosti v dosedaj dostopni literaturi nismo zasledili, smo s prvo raziskavo želeli preveriti hipotezo, da višji odmerek citrata v primerjavi s standardnim (do sedaj uporabljanim) odmerkom citrata izboljša biokompatibilnost in hkrati ne predstavlja večje obremenitve bolnika s citratom. Ker so raziskave o biokompatibilnosti različnih vrst antikoagulacije pri MPF zelo redke, smo v drugi raziskavi želeli preveriti hipotezo, da področna antikoagulacija s citratom v primerjavi s heparinsko antikoagulacijo pri MPF izboljša biokompatibilnost procedure. 1. RAZISKAVA: PRIMERJAVA DVEH ODMERKOV CITRATA PRI HEMODIALIZI Metode dela V randomizirano raziskavo smo vključili 30 bolnikov s končno ledvično odpovedjo, ki so bili starejši od 18 let, brez akutne infekcije, krvavitve, malignoma, antikoagulantne ali imunosupresivne terapije. Randomizirali smo jih v skupino s standardnim odmerkom citrata (2,7 mmol/L krvi) in v skupino z višjim odmerkom citrata (4,0 mmol/L krvi). Hemodializo smo izvajali s sintetičnimi visokopretočnimi dializatorji, dializatom brez kalcija in pretokom krvi 250 ml/min. Citratno antikoagulacijo smo izvedli z 8% trinatrijevim citratom, ki smo ga infundirali v arterijsko linijo s pretokom 150 ml/min v skupini s standardnim odmerkom in 220 ml/min v skupini z višjim odmerkom citrata. Kalcij smo nadomeščali z 1 M kalcijevim kloridom, infundiranim v vensko linijo, z začetnim pretokom 14 ml/h pri standardnem odmerku in 16 ml/h pri višjem odmerku citrata. Odmerek kalcija smo tekom procedure prilagajali, tako da smo vzdrževali ioniziran kalcij (iCa) iz arterijske linije v želenem ciljnem območju (1,0 - 1,2 mmol/l). Ob priklopu na hemodializo in po njej smo določili magnezij, celokupni in korigirani kalcij in hemogram. Plinsko analizo venske krvi in iCa smo določili vsako uro na obposteljnem ionometru. Za določitev parametrov biokompatibilnosti smo kri odvzeli iz žilnega pristopa (arterio-venske fistule ali hemodializnega katetra) pred začetkom hemodialize (t0), po 30 minutah iz venske linije (t30V) in po 4 urah hemodialize iz arterijske (t4A) in venske linije (t4V) dializnega sistema. Aktivacijo koagulacijske kaskade smo ocenili z merjenjem trombin-antitrombinskega kompleksa (TAT), aktivacijo trombocitov z merjenjem trombocitnega faktorja 4 (PF4) v serumu, aktivacijo levkocitov pa z merjenjem serumske mieloperoksidaze (MPO) in aktivacijo komplementa z merjenjem fragmenta C5a v krvni plazmi. Tekom procedure smo bili pozorni na morebitne zaplete citratne antikoagulacije. Učinek hemokoncentracije kot posledico ultrafiltracije med hemodializo smo izničili s korigiranjem merjenih parametrov biokompatibilnosti (c1) na izhodiščno vrednost hematokrita (Ht0) z uporabo naslednje formule: c1' = c1 * (Ht0 (1 – Ht1) / Ht1 (1 – Ht0)). Kot sekundarni izid smo z uporabo sekvenčne elektronske mikroskopije (SEM) prikazali adhezijo krvnih celic in odlaganje fibrina na notranjo površino dializnih vlaken. Iz vsake skupine smo naključno izbrali pet dializatorjev. Za ovrednotenje slik smo uporabili semikvantitativni sistem točkovanja, kjer smo ovrednotili: a) površino vlaken pokritih s celicami oz. drugim adheriranim materialom, b) nastanek fibrinske mreže, c) prisotnost skupkov eritrocitov, d) adhezijo trombocitov in e) obstrukcijo lumna vlaken. Vseh pet parametrov smo ocenili na lestvici od 0 do 4, glede na velikost površine vlakna, ki jo je proces zajel. Seštevek ocen vseh petih parametrov smo povzeli v skupno SEM ocena (razpon 0 - 20). Normalno razporejene spremenljivke smo med skupinami primerjali s Studentovim T testom, nenormalno razporejene pa z neparametričnim Mann-Whitneyjevim U-testom. Parametre biokompatibilnosti, merjene večkrat zapored, smo analizirali z analizo variance (ANOVA), z modelom za ponovljene meritve. V primeru statistično značilne interakcije med časom meritve in opazovano skupino smo z Bonferronijevim post-hoc testom določili med katerimi časovnimi točkami in v kateri skupini so bile prisotne razlike. Rezultati Vključenih je bilo 30 bolnikov, 15 v vsaki skupini. Uporabili smo dializator FX Cordiax pri 19/30 (64%) hemodializah in Polyflux H pri 11/30 (36%) hemodializah. V skupini z višjim odmerkom citrata smo ugotavljali nižje vrednosti iCa v dializnem krogu, kar govori za doseženi večji antikoagulacijski učinek visokega odmerka citrata. V nobeni od skupin ni bilo klinično zaznavnih težav s strjevanjem krvi med hemodializo, dializni sistemi ob koncu procedure so bili v obeh skupinah vizualno čisti. Med procedurami ni bilo primerov pomembne hipokalciemije (iCa < 0,9 mmol/l), bilo pa je 5 primerov metabolne alkaloze (pH > 7,5): 4 v skupini s standardnim in 1 v skupini z višjim odmerkom. Razmerje med korigiranim in iCa je ostalo normalno pri vseh bolnikih, kar kaže, da tudi pri višjem odmerku ni prišlo do kopičenja citrata. Prišlo je do blagega, a statistično pomembnega znižanja števila levkocitov po 30 minutah, ki je bilo primerljivo v obeh skupinah. Vrednosti trombocitov iz arterijske linije so bile stabilne, prišlo je le do blagega, a statistično značilnega porasta trombocitov preko dializatorja (venska vs. arterijska linija) po 4 urah dialize v obeh skupinah. Po 30 minutah smo beležili statistično pomemben porast koncentracije PF4 (iz 28 ± 17 na 47 ± 29 IU/ml oz. iz 30 ± 17 na 54 ± 33 IU/ml (p < 0,01)), časovni potek je bil primerljiv v obeh skupinah. Opazili smo povečanje koncentracije TAT po 4 urah dialize v vzorcih odvzetih iz arterijske linije (iz 3,9 ± 4 na 8,4 ± 7 ug/L oz. iz 3,1 ± 1,8 na 11,1 ± 19 ug/L (p < 0,01)), medtem ko so vrednosti v vzorcu iz venske linije upadle in niso bile več statistično pomembno povišane; tudi tukaj je bil časovni potek vrednosti TAT primerljiv v obeh skupinah. V obeh skupinah je prišlo do statistično značilnega, a majhnega, znižanja koncentracije MPO po 4 urah dialize v vzorcu odvzetem iz arterijske linije (iz 342 ± 260 na 300 ± 329 ng/ml oz. iz 242 ± 70 na 185 ± 86 mg/ml (p < 0,05)), znižanje je bilo primerljivo v obeh skupinah. Med dializo nismo zaznali pomembnega porasta C5a v nobeni od skupin. V naši raziskavi smo ugotavljali izredno nizko stopnjo adhezije celic in fibrina v obeh skupinah pri elektronski mikroskopiji, saj je bilo 25% vseh ocenjenih vlaken popolnoma čistih, v ostalih vzorcih pa smo ugotavljali le nekaj fibrinskih vlaken ali adheriranih celic (običajno manjše skupke trombocitov). Skupna SEM ocena je bila primerljiva in sicer v skupini s standardnim odmerkom citrata 2 (IQR 0 - 3), v skupini z višjim odmerkom citrata pa prav tako 2 (IQR 2 - 3, p = 0,59). Zaključki Kljub odsotnosti razlik med skupinama in nepopolnem zavrtju sproščanja PF4 in nastanku TAT pri večjem odmerku citrata, se zdi, da je standardni odmerek citrata (2,7 mmol/l krvi) pri RCA zadosten za uporabo pri kronični hemodializi. 2. RAZISKAVA: PRIMERJAVA HEPARINSKE ANTIKOAGULACIJE S CITRATNO ANTIKOAGULACIJO PRI MEMBRANSKI PLAZMAFEREZI Metode dela V raziskavo smo vključili 15 bolnikov, ki so potrebovali zdravljenje z MPF zaradi različnih indikacij. Kot nadomestno tekočino smo uporabili elektrolitsko mešanico z dodatkom albuminov v koncentraciji 30 g/l. Vključili smo le bolnike, ki niso imeli akutne krvavitve, malignoma ali okužbe in niso prejemali antikoagulantne terapije. Vsakega bolnika smo randomizirali, tako da je v naključnem zaporedju opravil eno proceduro MPF s heparinsko in eno s citratno antikoagulacijo. MPF smo izvajali s filtrom PlasmaFlux P2 Dry. Pri protokolu s heparinom smo ob priklopu aplicirali 2500 E heparina ter nadaljevali s 2000 E heparina na uro. Protokol s citratom je vključeval neprekinjeno infuzijo 8% trinatrijevega citrata v arterijsko linijo s pretokom 100 ml/min. Kalcij smo nadomeščali z infuzijo 1 M CaCl2 v vensko linijo s pretokom 7 ml/h, odmerek smo tekom procedure prilagajali in vzdrževali iCa v želenem ciljnem območju (1,0 - 1,2 mmol/l). Določali smo enake parametre biokompatibilnosti kot pri prvi raziskavi. Kri smo odvzeli iz žilnega pristopa pred MPF (t0), po 30 minutah iz arterijske (t30A) in venske linije (t30V) ter po koncu MPF iz arterijske linije (tend). Vzorce smo shranjevali in analizirali enako kot pri prvi raziskavi. Med MPF s citratno antikoagulacijo smo vsako uro določili plinsko analizo venske krvi in iCa na obposteljnem ionometru, ter bili pozorni na morebitne zaplete. Spremenljivke smo med skupinami primerjali s Studentovim T testom,. Parametre biokompatibilnosti, merjene večkrat zapored, smo analizirali z analizo variance (ANOVA), z modelom za ponovljene meritve. V primeru statistično značilne interakcije med časom meritve in opazovano skupino smo z Bonferronijevim post-hoc testom določili med katerimi časovnimi točkami in v kateri skupini so bile prisotne razlike. Rezultati V raziskavo smo vključili 15 bolnikov, vsi so opravili po eno heparinsko in eno citratno MPF. Med procedurami nismo opažali zapletov. Opažali smo le en primer metabolne alkaloze pri citratni MPF s pH 7,50. Pri analizi PF4 smo opažali statistično pomembno razliko v časovnem poteku PF4 med skupinama (interakcija časa in skupine). Pri bolj podrobni analizi smo ugotovili, da je do statistično značilnega porasta PF4 prišlo samo v heparinski skupini v vzorcu odvzetem po 30 minutah MPF iz venske linije. Pri analizi TAT smo ugotavljali statistično pomemben porast pri obeh skupinah, in sicer so porasle vrednosti ob koncu MPF glede na vrednosti po 30 minutah. Med skupinama pa ni bilo statistično pomembnih razlik v časovnem poteku. Pri analizi MPO je bila prisotna razlika v časovnem poteku MPO med skupinama in sicer so glede na izhodiščne vrednosti pred proceduro statistično značilno upadle vrednosti v citratni skupini, odvzete po 30 minutah iz venske linije in tiste, odvzete po proceduri. Tudi pri analizi C5a je bila prisotna razlika v časovnem poteku med skupinama. V obeh skupinah smo opažali upad vrednosti C5a ob koncu MPF glede na izhodiščno vrednost. Le v heparinski skupini pa smo opažali statistično pomemben porast C5a po 30 minutah MPF v vzorcu odvzetem iz venske linije v primerjavi s sočasnim vzorcem iz arterijske linije in tudi glede na izhodiščno vrednost, kar govori za aktivacijo komplementa v plazmafiltru med heparinsko antikoagulacijo. Zaključki V raziskavi smo uspeli dokazati pomembno boljšo biokompatibilnost pri MPF s citratno antikoagulacijo. Rezultati so pokazali nižjo aktivacijo komplementa in trombocitov, posredno pa verjetno tudi nižjo aktivacijo levkocitov, medtem ko razlike v aktivaciji koagulacijske kaskade med obema vrstama antikoagulacije ni bilo. Naša raziskava je ena redkih, ki raziskuje parametre biokompatibilnosti pri različnih načinih antikoagulacije med MPF in zato prispeva pomembne dokaze za prednost uporabe citrata tudi pri MPF.

• Language: Slovenian
• Keywords: Biokompatibilnost, hemodializa, komplement, membranska plazmafereza, mieloperoksidaza, regionalna antikoagulacija s citratom, trombin-antitrombin kompleks, trombocitni faktor 4
• Work type: Doctoral dissertation
• Organization: MF - Faculty of Medicine
• Year: 2025
• PID: 20.500.12556/RUL-168589
• Publication date in RUL: 18.04.2025

Secondary language

• Language: English
• Title: Biocompatibility of hemodialysis and plasmapheresis procedures with citrate anticoagulation

Abstract

ABSTRACT 1. STUDY: COMPARISON OF BIOCOMPATIBILITY OF REGULAR AND INCREASED DOSE OF CITRATE IN CHRONIC HEMODIALYSIS - A RANDOMIZED TRIAL Background The dose of citrate that is needed in RCA to achieve optimal biocompatibility of the extracorporeal circuit is not known. Insufficient biocompatibility is related with increased inflammation and oxidative stress and therefore higher risk for cardiovascular events, as well as decreased dialysis dose. Biocompatibility is multifaceted and includes activation of coagulation and complement cascades, as well as degranulation of leukocyte and platelets. We performed a randomized control trial to compare regular and increased dose of citrate in RCA. Methods 30 chronic hemodialysis patients were randomly assigned to a single hemodialysis session with RCA using either regular (2,7 mmol/L of blood) or increased dose of citrate (4 mmol/L of blood). Markers of activation of the complement system (C5a), activation of hemostasis (TAT), activation of platelets (PF4) and activation of leukocyte (MPO) were taken at the beginning (time 0), after 30 minutes (arterial line) and after 4 hours (arterial and venous line) of dialysis. Results were corrected for changes in the hematocrit. We also evaluated the inner surface of the dialyzer fibers with SEM. Results A good separation of the anticoagulation effect was achieved (post-filter ionized calcium 0.20 vs. 0.31 mmol/L, p < 0.05). There was no effect of citrate dose on any of the biocompatibility parameters. Transient and parallel increases in PF4 after 30 min and in TAT after 4 h were observed in both groups. No significant changes in MPO or C5a were observed during the dialysis in any of the groups. There were no visually detected clotting problems within the circuit and no significant hypocalcemia in either group. SEM clotting score was excellent and comparable in both groups (2 (IQR 0 - 3) vs. 2 (IQR 2 - 3), p = 0.59). Conclusions Given the excellent biocompatibility results in both groups, absence of between group differences and inability of the increased dose of citrate to completely blunt the small residual increase in PF4 and TAT, we conclude that the standard dose of 2,7 mmol/l of citrate seems sufficient in RCA for chronic hemodialysis. 2. STUDY: COMPARISON OF HEPARIN AND CITRATE ANTICOAGULATION IN MEMBRANE PLASMAPHERESIS Background There is very little data about biocompatibility of different anticoagulation methods in MPF. Therefore, we performed a single-center, cross-over, randomized trial comparing biocompatibility of heparin and citrate anticoagulation in membrane plasmapheresis (MPF). Methods 15 patients with various indications for membrane plasmapheresis (most of them with neurological diseases) were included. Each patient was assigned to a random sequence of one MPF with heparin and one MPF with citrate anticoagulation during their MPF treatment course. Biocompatibility was assessed by measuring markers of complement system activation (C5a), hemostasis activation (thrombin – antithrombin complex (TAT)), platelet activation (platelet factor 4 (PF4)) and leukocyte activation (myeloperoxidase (MPO)), which were determined at the beginning (time 0), after 30 minutes (from arterial and venous line) and after the end of plasmapheresis (from arterial line). Results We observed a statistically significant increase in PF4 only in the heparin group (in samples at 30 minutes from venous line). A significant and parallel increase in TAT was observed in both groups after 30 minutes from the venous line. MPO showed a decrease during the procedure, but only in the citrate group. A statistically significant release of C5a was observed within the plasmafilter (an increase from arterial to venous line) only in the heparin group at 30 minutes, while the levels decreased in both groups by the end of the procedure. Conclusions Our study is one of a few that investigated biocompatibility of different anticoagulation methods in MPF. The results showed a better biocompatibility of citrate anticoagulation, with lower increase in PF4 and C5a and greater decrease in MPO in the citrate anticoagulation group.

• Keywords: Biocompatibility, complement system, hemodialysis, membrane plasmapheresis, myeloperoxidase, platelet factor 4, regional citrate anticoagulation, thrombin–antithrombin complex