Vrednotenje imunomodulatornega učinka zunajceličnih veziklov Lacticaseibacillus casei in vitro

Rožanc, Ajda (author), Lunder, Mojca (mentor), Rodriguez Cabezas, Maria Elena (comentor)

Probiotiki so skupki živih mikroorganizmov, ki imajo ob apliciranju v zadostnih količinah koristne učinke na zdravje gostitelja. Predstavljajo eno izmed ključnih strategij za zdravljenje disbioze, stanja neravnovesja med koristnimi in potencialno patogenimi bakterijami, ki je povezano z različnimi zdravstvenimi stanji. Njihova uporaba se je v zadnjih letih zelo razširila. Kljub splošno priznani varnosti pri uporabi so zabeleženi primeri neželenih učinkov, pri čemer so najresnejše okužbe zlasti pri ranljivih skupinah, kot so kritično bolni, nedonošenčki in posamezniki z oslabljenim imunskim sistemom. Mehanizem delovanja probiotikov še ni povsem pojasnjen. Znano je, da lahko krepijo črevesno pregrado, izpodrivajo patogene organizme in proizvajajo protimikrobne snovi. Izkazujejo tudi širok spekter encimskih aktivnosti in imajo sposobnost moduliranja imunskega sistema. Postbiotiki so definirani kot pripravki neživih mikroorganizmov in/ali njihovih komponent, ki prinašajo zdravstveno korist za gostitelja. V primerjavi s probiotiki prinašajo številne prednosti, kot so zmanjšanje tveganja za mikrobno translokacijo, okužbo in prenos genov, odpornih na antibiotike, daljši rok trajanja, lažje shranjevanje in enostavnejšo standardizacijo. Med postbiotike sodijo tudi zunajcelični vezikli (ZV). To so sferični, dvoslojni proteolipidi, dimenzij od 20 do 300 nm, ki jih bakterije sproščajo v zunajcelični prostor. ZV vsebujejo bioaktivne proteine, metabolite, lipide in nukleinske kisline in so pomemben dejavnik v medcelični komunikaciji. Molekule na površini ZV se lahko pripnejo na zunajcelične proteine ali specifične receptorje gostiteljske celice in sprožijo primarno reakcijo. ZV nosijo tudi skupine molekul, imenovane s patogeni povezani molekularni vzorci (angl. pathogen-associated molecular patterns – PAMPs), ki jih prepoznajo vzorčno prepoznavni receptorji (angl. pattern recognition receptors – PRRs) in sprožijo različne signalne poti. L. casei je po Gramu pozitivna bakterija, široko uporabljena v fermentiranih živilih in probiotičnih izdelkih, skupaj z drugimi koristnimi bakterijami. Številne študije nakazujejo, da bi bakterija L. casei lahko olajšala številne bolezni, med drugim srčno-žilne bolezni, debelost, delovala kot zaščita pred nastopom sladkorne bolezni tipa 2 in blažila škodo, povzročeno zaradi črevesnih bolezni. Prav tako je dokazano, da zmanjša pojavnost in trajanje driske pri otrocih in zdravih mladih odraslih. Več študij nakazuje, da imajo specifični sevi L. casei imunomodulatorne lastnosti in lahko vplivajo na izločanje citokinov. Hipoteza te študije je, da sev L. casei proizvaja zunajcelične vezikle, ki bi lahko imeli pomembno vlogo pri imunomodulatornem učinku seva. Cilji raziskav so zato vključevali preverjanje, ali sev L. casei proizvaja zunajcelične vezikle, karakterizacijo le-teh in ocenitev vpliva seva L. casei ter njegovih ZV na dveh različnih in vitro modelih. Specifični sev, ki je uporabljen v tej študiji, je trenutno v procesu pridobitve patenta, zato polnega imena seva trenutno ni mogoče razkriti. Prvi ključni korak je bila ekstrakcija ZV iz celične kulture. Po uspešni kultivaciji seva L. casei smo bakterije in celične ostanke odstranili s pomočjo centrifugiranja, filtriranja in ultracentrifugiranja. Tako prečiščene ZV smo nato kvantificirali s pomočjo Bradfordove metode, ki temelji na barvni reakciji med hidrofobnim barvilom in proteini. ZV smo vizualizirali z uporabo visoko ločljivega transmisijskega elektronskega mikroskopa. Porazdelitev velikosti ZV smo določili z uporabo Zetasizer Nano ZSP. Za in vitro študije smo uporabili dve celični liniji, in sicer RAW 264 (mišji makrofagi) in Caco-2 (humane epitelijske celice kolorektalnega raka). Preden smo se lotili raziskovanja imunomodulatornih učinkov ZV, smo s testom celične viabilnosti preverili, ali so ZV ali sev L. casei citotoksični. Celice smo inkubirali z ZV različnih koncentracij in sevom L. casei. Po inkubaciji smo celično viabilnost določili z uporabo testa proliferacije celic CellTiter 96® AQueous One Solution. Reagent vsebuje tetrazolijevo sol (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil))-2H-tetrazolijevo sol (MTS), ki jo presnovno aktivne celice reducirajo do topnega formazana, pri čemer pride do obarvanja, ki ga je mogoče izmeriti spektrofotometrično. Količina nastalega produkta je neposredno sorazmerna številu živih celic v kulturi. V obeh celičnih linijah so se ZV in L. casei izkazali kot necitoksični. Nadaljevali smo s testi za dokazovanje imunomodulatornega učinka L. casei in ZV izbranih koncentracij. Zanimalo nas je, ali ZV in L. casei lahko zavrejo celično proizvodnjo dušikovega oksida (NO) v stimuliranih celicah RAW 264. NO deluje kot vnetni mediator in igra ključno vlogo pri kroničnem vnetju. Izvedli smo Griessov test, ki predstavlja indirektno metodo za določanje NO preko nitrita (NO2–), enega od dveh primarnih, stabilnih in nehlapnih razgradnih produktov NO. Griessov reagent vsebuje sulfanilno kislino in N-[1-naftil]etilendiamin. V kislem okolju sulfanilna kislina reagira z NO2–, pri čemer nastane diazonijeva sol, ki se nato združi z N-[1-naftil]etilendiaminom v visoko obarvano azo spojino, ki jo lahko zaznamo spektrofotometrično. Celice RAW 264 smo stimulirali z lipopolisaharidom (LPS), ki je močan imunostimulator in v celicah sproži vnetni odziv, ter tretirali z ZV različnih koncentracij in sevom L. casei. Po 24 urah smo zbrali supernatante in izvedli test. Sledila je analiza genskega izražanja. Zanimalo nas je, ali ZV in L. casei vplivajo na gensko izražanje interlevkina 6 (Il-6) ali dejavnika tumorske nekroze alfa (Tnf-α), ki igrata pomembno vlogo v imunskem odzivu. Celice RAW 264 smo predinkubirali z ZV in sevom L. casei ter stimulirali z LPS. Kot kontrolo smo uporabili celice brez tretiranja in stimulacije, kot pozitivno kontrolo pa celice brez predhodnega tretiranja, stimulirane z LPS. Zatem je bila izvedena ekstrakcija RNA z uporabo reagenta NucleoZOL® in reverzna transkripcija za sintezo komplementarne DNA. Nato smo izvedli amplifikacijo tarčnih genov z uporabo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) s fluoroforom SYBR GREEN. Za izvedbo statističnih analiz smo uporabili GraphPad 8.4.2. Študija je pokazala, da je sev L. casei zmožen proizvajati zunajcelične vezikle. Ugotovili smo, da nobena od preučevanih koncentracij ZV ni citotoksična za Caco-2 celice, niti za celice RAW 264. Rezultati te študije kažejo, da ZV lahko modulirajo imunski sistem. Sev L. casei in njegovi ZV so zmanjšali proizvodnjo NO v celicah RAW 264, stimuliranih z LPS-om, kar nakazuje, da so ZV lahko koristni pri zdravstvenih stanjih, kjer je prisotna prekomerna proizvodnja NO. Prikazali smo tudi zmanjšano izražanje Il-6 in Tnf-α mRNA v LPS-stimuliranih celicah RAW 264, tretiranih z ZV, kar nakazuje, da bi ZV lahko bili koristni pri obvladovanju bolezni, ki jih spremlja prekomerno vnetje. Čeprav lahko to študijo štejemo kot preliminarno, bi ZV lahko igrali ključno vlogo pri imunomodulatornih lastnostih L. casei in bi jih lahko obravnavali kot obetavno terapevtsko orodje v primerih, ko žive probiotične bakterije niso priporočljive. Pomembno je omeniti, da so potrebne nadaljnje raziskave, vendar je ta študija odprla novo smer raziskav, ki vzbuja veliko zanimanje. ZV, pridobljeni iz L. casei, bi lahko postali del terapevtske strategije za različna stanja, pri katerih prevladuje vnetni proces.

• Language: Slovenian
• Keywords: probiotiki, postbiotiki, zunajcelični vezikli, L. casei, imunomodulatorna aktivnost
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2024
• PID: 20.500.12556/RUL-164811
• Publication date in RUL: 13.11.2024

Secondary language

• Language: English
• Title: In vitro evaluation of immunomodulatory effect of Lacticaseibacillus casei extracellular vesicles

Abstract

Probiotics are live microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host. They are a prevailing strategy to treat dysbiosis, i.e., an imbalance between beneficial and potentially pathogenic bacteria in the gut, which is associated with various health conditions. Probiotics have gained popularity over the past years and are widely used for their health benefits. However, it is important to note that they also have some drawbacks, including short shelf life and potential side effects, most notably infection in more vulnerable patients. A postbiotic is a preparation of inanimate microorganisms and/or their components that confers a health benefit on the host. These postbiotics offer a promising solution to address some of the associated drawbacks. Probiotic-derived extracellular vesicles are considered postbiotics and are spherical, bilayered proteolipids containing specific subsets of bioactive molecules. Lacticaseibacillus casei has demonstrated significant potential in treating various diseases, including cardiovascular diseases, intestinal diseases, and cancer. The specific strain of L. casei used in this study is currently undergoing the patent process, and therefore, the full name cannot be disclosed at this time. The hypothesis of this study is that the L. casei strain is capable of producing extracellular vesicles (EVs), which may play a crucial role in its immunomodulatory effects. Thus, the objectives were to isolate EVs and evaluate their immunomodulatory activity in vitro. EVs were extracted through centrifugation, characterized using transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS) with Zetasizer Nano ZSP, and utilized as a treatment, along with the L. casei strain, in Caco-2 and RAW 264 cell lines. The results demonstrated that L. casei EVs had no effect on cell viability, decreased the production of nitric oxide (NO) in RAW 264 cells stimulated with lipopolysaccharides (LPS), and reduced the expression of interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in LPS-stimulated RAW 264 cells. Based on these results, we can conclude that L. casei can produce EVs, which display immunomodulatory effects that may play an important role in beneficial activity to the host, thereby opening new avenues for promising future treatments.

• Keywords: probiotic, postbiotic, extracellular vesicles, L. casei, immunomodulatory activity