Optimizacija čiščenja in razvoj metod za funkcionalizacijo ter visokoločljivostno slikanje virusu podobnih delcev krompirjevega virusa Y

Tomsič, Nika (author), de Marco, Ario (mentor), Dolinar, Marko (comentor)

Nanotehnologija ima pomembno vlogo v medicini. Dober primer prenosa nanotehnologije v medicino so nanotelesa. To so rekombinantne variabilne domene težke verige, ki izhajajo iz kamelidnih protiteles. Nanotelesa imajo značilno tridimenzionalno strukturo, imenovano imunoglobulinsko zvitje, ki predstavlja sendvič dveh antiparalelnih β-struktur, povezanih z disulfidno vezjo. Zvitje vsebuje tri zelo variabilne regije, ki tvorijo zanke, s katerimi nanotelo prepozna konkavne epitope na tarčni molekuli. V raziskovanju so uporabni pri čiščenju proteinov in imunoprecipitaciji, kadar pa so ti označeni še z barvili, lahko z njimi tudi lokaliziramo proteine in jih opazujemo pod mikroskopom. Uporaba nanoteles predstavlja veliko prednost pred klasični protitelesi. Glavna prednost je njihova velikost, saj so veliki le približno 15 kDa, kar jim omogoča dobro porazdeljenost po telesu in prodiranje v tkivo. Pomembno je tudi to, da so stabilni pri različnih pH, temperaturi in ionski moči ter topni v vodnih raztopinah. Njihova specifičnost pri vezavi omogoča, da jih lahko uporabimo tako pri diagnostiki kot pri terapevtiki. Zaradi homologije s človeškimi protitelesi nanotelesa večinoma ne povzročajo imunskega odziva. So tudi splošno varna za uporabo, čeprav so po vnosu v telo v nekaterih primerih opazili kopičenje v ledvicah. Zelo učinkovit in cenovno ugoden način pridobivanja nanoteles je z izražanjem rekombinantnih proteinov v bakteriji Escherichia coli. Kljub temu sinteza nanoteles v bakterijah ni brez izzivov, saj reducirajoče okolje v citoplazmi ovira pravilno nastajanje disulfidnih vezi. Bolj primerno okolje za pravilno zvitje je periplazma, kjer pa so izpleni manjši. Problema reducirajoče citoplazme se lahko lotimo s sočasnim izražanjem encima sulfhidril oksidaze, ki oksidira proste cisteine. V terapevtiki so nanotelesa že v uporabi in lahko delujejo na tri načine: • tako, da ciljajo glikoproteine virusne ovojnice in tako virusu preprečijo vstop v celico; • tako, da ciljajo na gostiteljeve proteine, kar preprečuje njihovo interakcijo z virusnim delcem; • kot imunomodulatorji, ker vplivajo na encime, ki so ključni pri razmnoževanju virusa. V nanotehnologiji poleg nanoteles pogosto uporabljajo virusu podobne delce (VLP). To so nekužni delci, ki so zelo podobni virusom, vendar ne vsebujejo virusnega genskega materiala. V medicini predstavljajo velik potencial pri tarčni dostavi zdravil, načrtovanju na virusu osnovanih cepiv in pri imunoterapiji. Njihova proizvodnja je cenovno ugodna, saj lahko plaščne proteine proizvedemo v bakteriji E. coli. Plaščni proteini so se sposobni samostojno sestaviti v kapsido premera od 10 do 200 nm. Kompleksi so večinoma biokompatibilni in stabilni pri različnih pH in temperaturi. VLP-ji lahko tvorijo drugačno strukturo od naravne. Za uporabo v medicini jih lahko spremenimo tako, da nanje vežemo terapevtike. Obstaja več načinov za konjugacijo VLP-jev, med katere prištevamo genski inženiring. Krompirjev virus Y uvrščamo v rod Potyvirus znotraj družine Potyviridae. Virusni delec obdaja enoverižno pozitivno smerno RNA, ki zapisuje deset proteinov. Eden izmed njih je plaščni protein. Sestavljen je iz osrednje globularne regije, iz sedmih α-vijačnic in ene β-zanke ter fleksibilnih N- in C- končnih regij. N-končna regija je odgovorna za interakcijo s sosednjimi plaščnimi proteini pri tvorbi strukture virusnega delca, C-končna regija pa za interakcijo z virusno RNA. Virusu podoben delec, pripravljen z združevanjem plaščnih proteinov, proizvedenih v E. coli, ima drugačno obliko od naravnega virusnega delca. Proteini se združijo v dvojne heksamerne obroče, v orientaciji glava proti repu. Če pa te plaščne proteine točkovno mutiramo na specifičnih mestih, bo struktura dugačna: a) pri mutacijah K176E, G193C in G193D se heksamerni obroči postavijo v orientaciji glava proti glavi; b) pri mutacijah K176C ali K176S se heksameri usmerijo ortogonalno tako, da tvorijo kubično strukturo iz osmih obročev; c) pri mutaciji K177E nastane kroglasta struktura. Cilj magistrske naloge je bila optimizacija čiščenja VLP-ja. Poleg tega smo želeli ugotoviti, ali je kubična struktura VLP-ja krompirjevega virusa Y primerna za vezavo nanoteles. Cilj je bil sestaviti multivalentno strukturo, ki bi jo lahko v medicini uporabljali za vezavo različnih epitopov istega patogena, kar bi bil pomemben dosežek v boju proti superodpornim patogenom. Za vezavo smo uporabili sistem SpyTag-SpyCatcher, ki deluje po principu tvorbe izopeptidne vezi med aspartatom v peptidu SpyTag in lizinom v domeni površinskega proteina bakterije Streptococcus pyogenes. Za osnovo smo uporabili mutirano obliko plaščnega proteina krompirjevega virusa Y velikosti 22 kDa, ki se sestavi v kubično strukturo. Kubično strukturo sestavlja 48 kopij tega proteina, kar predstavlja 1065 kDa velik virusu podobni delec, ki ima na površini 48 SpyTagov za vezavo liganda. Plaščni protein smo najprej poskusili očistiti s precipitacijo z 0,5 M NaCl in polietilenglikolom 8000 ter ultracentrifugiranjem v saharoznem gradientu. Čiščenje je bilo neuspešno, ker se je protein med precipitacijo ireverzibilno oboril. Problem obarjanja smo rešili tako, da smo polietilenglikol 8000 zamenjali z amonijevim sulfatom. Plaščni protein je bil prisoten v frakcijah s 35 % saharoze, 55 % saharoze in v rjavi usedlini. Analiza čistosti proteina je pokazala, da je protein v oborini sprejemljivo čist. Vendar pa so vzorci po ultracentrifugiranju vsebovali še nekaj nečistoč, zato s to metodo nismo bili zadovoljni. Poleg tega pa je bil postopek čiščenja in menjave pufra po čiščenju zamuden. Čiščenje proteina smo zato poskusili izvesti s kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Najprej smo preizkusili kolono HiPrep 26/60 Sephacryl S 200 HR. Ker se to kolono uporablja za čiščenje manjših proteinov (5-250 kDa), smo naš virusu podoben delec pričakovali v prostem volumnu. Na elucijskem diagramu smo dobili le en vrh, ki je pomenil elucijo vseh proteinov hkrati, zato smo preizkusili še kolono HiPrep 26/60 Sephacryl S-500 HR za ločevanje proteinov velikosti med 40 in 20 000 kDa ter virusu podobnih delcev. Na elucijskem diagramu je bilo tokrat več vrhov. Želeni protein je se eluiral pri elucijskem volumnu 200 ml. Eluat smo očistili še z anionskoizmenjevalno kromatografijo. Vlogo liganda na naših VLP-jih je imelo nanotelo, ki prepoznava protein CD20. To je transmembranski neglikoziliran fosfoprotein limfocitov B, ki je izjemno pomemben pri diferenciaciji in rasti celic, zaradi česar je ključna tarča v raziskavah nekaterih rakov in avtoimunskih boleznih. Konstrukt liganda smo pripravili tako, da je vseboval še oznako 6×His za lažje čiščenje, zaporedje SpyCatcher za vezavo na VLP in YFP za detekcijo in slikanje na mikroskopu. Analiza strukture s ColabFold v1.5.5 je pokazala, da povezovalna mesta med domenami omogočajo veliko fleksibilnost, kar olajša vezavo med SpyTagom in SpyCatcherjem. Ligand smo očistili s kobaltovo afinitetno in ionskoizmenjevalno kromatografijo. S 30 minutnim mešanjem čistega liganda in VLP-jev smo ustvarili pogoje za vezavo liganda na VLP-je. Analiza s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (SDS-PAGE) je pokazala šibko liso na mestu, višjem od pričakovanega. Odstopanje od pričakovane velikosti je verjetno posledica nastanka razvejanega konstrukta, saj se SpyCatcher ne nahaja na terminalnem delu liganda, temveč med zapisom za nanotelo in oznakama 6×His in YFP. Razvejani proteini pa potujejo drugače kot linearni zaradi svoje kompleksne oblike. Na gelu nativne agarozne gelske elektroforeze (AGE) smo pričakovali dve fluorescenčni lisi: eno od liganda in drugo od kompleksa. Lise kompleksa nam ni uspelo zaznati in menimo, da je za to kriva prenizka koncentracija kompleksa. Čiščenje kompleksa z ionskoizmenjevalno kromatorgrafijo ni uspelo iz istega razloga. Uspešnost vezave SpyCatcherja na VLP smo preverili z vezavo konjugiranega SpyCatcherja in fluorescenčnega proteina mRuby na VLP. SDS-PAGE je pokazal liso na pričakovani višini, kar potrjuje prisotnost kompleksa. Vendar tudi tega kompleksa ni bilo mogoče opaziti na gelu nativne AGE zaradi prenizke koncentracije. Ugotovili smo, da je najbolj učinkovita metoda čiščenja VLP-ja kromatografija z ločevanjem po velikosti s kolono HiPrep 26/60 Sephacryl S-500 HR, ki ji sledi ionskoizmenjevalna kromatografija. Čeprav je bila pri naših poskusih koncentracija končnega proteina nizka zaradi redčitve, ki je posledica uporabe kolone za ločevanje po velikosti, smo dosegli visoko čistost proteina. S konstruktom SpyCatcher-mRuby nam je uspelo dokazati vezavo liganda na VLP, čeprav je bilo kompleksa zelo malo. Cilj magistrske naloge je bil tudi najti način, kako bi lahko strukturo kompleksa bolje vizualizirali. Zato smo želeli proizvesti nanotelesi, ki prepoznavata CD20 in glikoprotein CD63 z nenaravno aminokislino 4-azidofenilalaninom, ki reagira s fluorescenčnim barvilom Cyanine5.5 dibenzociklooktin. To bi namreč omogočilo vizualizacijo strukture kompleksa z višjo ločljivostjo. Uporabili smo plazmid pDule2-pCNP, ki vsebuje zapis za specifični tRNA in tRNA-sintetazo za uvedbo nenaravne aminokisline na mesto, kodirano s kodonom TAG. Stop kodon smo uvedli v osrednji del zaporedja nanotelesa ali med oznaki 6×His in AviTag v del zapisa za C-konec fuzijskega proteina. Sinteza nanotelesa, ki prepozanava CD63 in ki je imelo na C-koncu uspešno vključeno nenaravno aminokislino, je uspelo kadar a) so celice sočasno izražale še sulfhidril oksidazo in b) smo nekanonično aminokislino dodali v gojišče šele pri indukciji izražanja.

• Language: Slovenian
• Keywords: virusu podoben delec, krompirjev virus Y, optimizacija čiščenja, sistem SpyTag-SpyCatcher, nekanonične aminokisline
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FKKT - Faculty of Chemistry and Chemical Technology
• Year: 2024
• PID: 20.500.12556/RUL-164453
• Publication date in RUL: 25.10.2024

Secondary language

• Language: English
• Title: Optimisation of the purification process of Potato virus Y virus-like particle and development of methods for its functionalisation and super-resolution imaging

Abstract

Nanotechnology plays an important role in medicine. One of the most significant advancements in this field is the use of nanobodies since they represent a major advantage over classical antibodies. The main advantages are their small size (15 kDa), effective biodistribution and short circulation time, elevated tissue penetration, stability, solubility and biocompatibility. Also, virus-like particles (VLPs) are often used in nanotechnology. These are non-infectious virus particles because they do not contain viral genetic material. In medicine, they have been exploited for targeted drug delivery, as vaccines and in immunotherapy. An interesting example is the Potato virus Y, the main pathogen of potatoes. Mutations of its coat protein induce the formation of VLPs of an eight-ring cubic structure. The aim of the thesis was to optimize the purification protocol for the Potato virus Y coat protein fused to SpyTag on its C-terminal and to prove that the corresponding purified cubic VLPs can be functionalized with nanobodies using the SpyTag-SpyCatcher system. This would serve as the proof of concept for the use of such structures in medical applications, for example in pathogen targeting. Additionally, the incorporation of 4 azido-L-phenylalanine (4AZF) into nanobody sequences for direct conjugation with a dye was attempted to prepare reagents for super-resolution microscopy. The purification protocol was optimized by combining size exclusion and anion exchange chromatography. The binding of nanobodies onto VLPs was proved, but its efficiency remained low, and the complex was below the detection limit of native agarose gel electrophoresis. It is unclear if this was due to the low accessibility of SpyTag on the VLP’s structure. The construct in which the 4AZF was incorporated was successfully prepared using the following conditions: a) the amber codon was inserted between the nanobody sequence and the sequences of 6×His tag and AviTag, b) sulfhydryl oxidase was co-expressed to allow correct nanobody folding; c) specific tRNA, tRNA synthetase, and synthetic non-canonical amino acid (4AZF) were present when protein expression was induced.

• Keywords: virus-like particle, potato virus Y, purification optimisation, SpyTag-SpyCatcher system, non-canonical amino acids