Optimizacija in validacija reverznofazne tekočinske kromatografske metode za analizo trans-cinamaldehida in njegovih nečistot

Topalov, Kristijan (author), Pajk, Stane (mentor), Adams, Erwin (comentor)

Trans-cinamaldehid (TCA) je znana glavna aktivna sestavina olja cimetove skorje. Eterična olja cimeta pa vsebujejo več kot 300 hlapnih fenolnih in polifenolnih spojin, ki se proizvajajo s parno destilacijo, kjer TCA predstavlja približno 90% mešanice. TCA je rumena tekočina, rahlo topna v vodi, ki je sestavljena iz fenilnega obroča, povezanega z alfa-beta nenasičenim aldehidom, kjer je karbonilna skupina konjugirana z alkenom. Ta molekula zaradi visoke reaktivnosti ima omejeno število aplikacij. Uporablja se kot začimba in aroma v hrani, pijači, žvečilnih gumijih in zobozdravstvenih izdelkih, kot zaviralec korozije za jeklo in druge zlitine, kjer tvori zaščitno prevleko na kovinski površini ter kot aroma v formulacijah parfumov. TCA je zanimiv tudi iz stališča farmacije in medicine, ker ima antibakterijske, protirakave, antidiabetične in biomarkerske učinke. Čeprav ima TCA v medicini veliko potencialnih aplikacij, trenutno ne obstaja metoda, ki bi omogočala istočasno določanje TCA, dejanskih nečistot, ki izvirajo iz sintetičnih in naravnih virov ter potencialnih produktov razgradnje. V tej študiji smo razvili in validirali reverzno fazno gradientno metodo tekočinske kromatografije. V tej raziskavi smo uporabili izsledki študije Ranjana S., ki je bila izvedena v istem laboratoriju, kot izhodišče za razvoj metode za ločevanje nečistot in verjetnih razpadnih produktov TCA (11). Nadalje smo optimizirali že razvito metodo iz dveh ključnih razlogov. Najprej smo želeli vključiti več nečistot, ki bi lahko bile prisotne v sintetiziranih vzorcih TCA, zlasti nečistote, ki bi lahko izvirale iz procesa sinteze ali razpada in so bile omenjene v nekaterih študijah v literaturi, kot so 2-metoksiacetofenon, benzojska kislina, benzaldehid, trans-cimetova kislina in acetofenon. Drugi razlog za nadaljnjo optimizacijo metode je bila možnost, da so vzorci TCA lahko tudi iz naravnega izvora. Ker so naravni viri kompleksne mešanice, ki vsebujejo vrsto spojin, so lahko po čiščenju in ekstrakciji TCA iz različnih delov cimeta, v vzorcih še vedno prisotne nekatere druge sestavine. Zato smo pri optimizaciji metode na podlagi podatkov iz literature za naravni TCA vključili nečistote, kot so evgenol, 2-metoksicinamaldehid, 2-metoksibenzaldehid in cinamil acetat. Vse te nečistote smo poskusili ločiti s kromatografsko metodo. Za dosego boljše separacije in ločitve več nečistot od glavnega vrha (TCA) smo testirali vpliv različnih parametrov na separacijo. Med optimizacijo in razvojem nove metode smo VII uporabljali raztopino TCA (1 mg/ml) s 5 µg/ml vseh nečistoč. Optimalno ločevanje smo omogočili z uporaba binarnih mešanic acetonitrila, mravljinčne kisline in vode, s pretokom 1.2 ml/min na koloni YMC C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 µm). Pri tem smo izvedli UV detekcijo pri valovni dolžini 258 nm, ki smo jo izbrali za zagotovitev dobre detekcije za večino potencialnih nečistot, čeprav je TCA pokazala največjo absorpcijo pri 290 nm. Uvedli smo gradientno metodo pri temperaturi kolone 55°C, namesto že razvite izokratske metode, da bi povečali ločljivost in dobro ločitev med vsemi vrhovi ter dosegli najkrajši razumni čas analize. a oceno kakovosti in učinkovitosti zdravilne učinkovine je ključnega pomena poznavanje profila nečistot. Možne nečistote lahko izvirajo iz izhodne kemikalije, reagentov, stranskih produktov, intermediatov, poleg tega pa se lahko med shranjevanjem pojavijo nove nečistote. Uvedba poskusov prisilne razgradnje omogoča proizvodnjo verjetnih produktov razgradnje analita. Na ta način lahko pridobimo dodatne informacije o možnih poteh razpada učinkovine, identificiramo produkte razpada in razvijemo ustrezne metode za analizo, v krajšem času. TCA smo podvrželi petim različnim pogojem razgradnje, vključno s kislimi, bazičnimi in nevtralnimi pogoji, oksidativnim stresom in svetlobno obremenitvijo. Med študijo smo ugotovili, da se najverjetneje tvorita benzaldehid in trans-cimetna kislina v večjih količinah ter dve neznani nečistoti, ki sta se predvsem pojavili med oksidacijo in fotorazgradnjo. Zato smo v tej študiji dodatno poskušali identificirati neznane nečistoče. Razvili smo metodo, ki smo jo uspešno validirali glede selektivnosti, občutljivosti, linearnosti, natančnosti in točnosti, v skladu z mednarodnimi smernicami. Uspešno smo ločili vnesene nečistoče od glavnega vrha, pri čemer smo določili meje detekcije in kvantifikacije TCA, ki znašajo 0,003 µg/ml oziroma 0,01 µg/ml. Ugotovili smo linearni odnos od vsake meje kvantifikacije do 100 µg/ml za vsako od vnesenih nečistot, medtem ko smo za TCA opazili razpon od 0,01 µg/ml do 250 µg/ml. Z uporabo eksperimentalne zasnove smo raziskali robustnost metode in testirali najpomembnejše pare vrhov pod majhnim vplivom ključnih kromatografskih parametrov, kot so odstotek acetonitrila v mobilni fazi B, temperatura kolone (°C) in odstotek mravljinčne kisline v mobilni fazi A. Rezultati so potrdili, da je metoda robustna in da majhne spremembe parametrov metode ne bodo bistveno vplivale na rezultate. Validacija metode je potrdila, da je metoda uporabna in pimerna v najrazličnejših laboratorijih. VIII Razvito metodo smo uporabili za oceno kakovosti snovi iz različnih virov in sestavljenih formulacij. Potrditev in identifikacija že izločenih nečistot sta bili opravljeni s pomočjo dodatnih testov. Pri karakterizaciji snovi smo uporabili različne pristope, med katerimi so bili potrditev relativni zadrževalni (retencijski) čas s pomočjo referenčnega standarda, uporaba tekočinska kromatografija s detektorjem z nizom fotodiod za primerjavo UV spektrov s referenčnim standardom in dodatni poskusi za identifikacijo neznanih spojin z masnim spektrometrom v kombinaciji s HPLC ali plinsko kromatografijo. Opazovali smo star stekleni vsebnik s TCA iz leta 2014, ki je imel kristale na vrhu in oranžno-rumenkasto tekočino. To nas je spodbudilo, da najdemo najboljši način shranjevanja TCA, da bi preprečili njegov razpad v steklenici. Izvedli smo dodatne teste, da bi preučili, kako zaščititi TCA pred razpadom. Na podlagi rezultatov testov, podatkov iz literature in študij o prisilni razgradnji smo oblikovali smernice za najboljši način shranjevanja TCA, ki je hlapna in reaktivna spojina ter občutljiva na zrak in svetlobo. Najboljši način shranjevanja je uporaba zatemnjenih vial ali prosojnega stekla v temnem prostoru, hranjenje v hladilniku pri nizkih temperaturah od 2°C do 9°C in prepihovanje vsebnika z inertnim plinom po vsakem odprtju vsebnika. S tem načinom upočasnimo razpadanje TCA, zmanjšamo nastanek nečistoč ter ohranimo vsebnost TCA in zagotovimo njegovo varnost.

• Language: Slovenian
• Keywords: trans-cinamaldehid, validacija, ocena kakovosti, nečistote, RP-HPLC
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2023
• PID: 20.500.12556/RUL-144977
• Publication date in RUL: 27.03.2023

Secondary language

• Language: English
• Title: Optimization and validation of a reversed phase liquid chromatographic method for analysis of trans-cinnamaldehyde and its impurities

Abstract

The primary active component of cinnamon bark oil is well-known to be trans-cinnamaldehyde (TCA). Despite the fact that TCA has a variety of possible medical uses, there is currently no method for simultaneously determining trans-cinnamaldehyde, its actual impurities from synthetic and natural origin, and any potential degradation products. Thus, a gradient reversed phase liquid chromatographic method has been developed and validated in the current study. This method can be used in a wide range of circumstances in laboratories for various industries. In order to get a better separation and separate more impurities from the main peak of interest (TCA), the influence of various parameters on the separation has been tested. The optimum separation could be obtained using binary mixtures of acetonitrile, formic acid and water on a YMC C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm). UV detection was performed at a wavelength of 258 nm. The detection and quantification limits of TCA were 0.003 µg/ml and 0.01 µg/ml, respectively. In order to include more possible impurities beside those from the manufacturing process available in literature, we induced potential degradation products which can be formed during storage or shelf life of the substance. Several forced degradation studies, under different stress conditions were conducted. Cis and trans-cinnamic acid, benzaldehyde, cinnamyl acetate, 2-methoxybenzaldehyde and other trans-cinnamaldehyde degradation products were among the substances that could be identified. Further, the developed method has been validated in terms of selectivity, sensitivity, linearity, precision, and accuracy, according to international guidelines. The robustness of the method was investigated using an experimental design. Finally, the method was employed to evaluate the quality of bulk substances from various sources and compounded formulations. Since TCA is also a widely used flavoring ingredient, the new method can be applied both in the pharmaceutical and food industry.

• Keywords: trans-cinnamaldehyde, validation, quality evaluation, impurities, RP-HPL