Development of hypothalamic dopaminergic neurons and their role in anxiety-like behaviour in mice : master's thesis

Zupančič, Maja (author), Harkany, Tibor (mentor), Keimpema, Erik (comentor)

Anksiozne motnje so prisotne pri 28 % odraslih, kar jih uvršča med najpogostejše duševne motnje. Anksiozne motnje v času odraščanja lahko pustijo dolgoročne posledice in so velik dejavnik tveganja za razvoj depresije in drugih psihiatričnih motenj kasneje v življenju. Zato je razumevanje, kako napake in motnje med razvojem, vključno z oblikovanjem možganskih povezav, vplivajo na pojav anksioznosti, ključnega pomena. Anksioznost je definirana kot kompleksno, neprijetno fiziološko in psihološko stanje, ki se pojavi kot pretiran odgovor na potencialno nevarno situacijo. Anksioznost delimo na adaptivno, ki igra vlogo obrambnega mehanizma pred potencialno nevarnimi situacijami v vsakdanjem življenju, in patološko anksioznost. Slednja se kaže kot pretiran strah in kronična anksioznost, ki ni več del koristnega, adaptivnega odziva in vodi do pojava anksioznih motenj. Anksiozne motnje so skupina duševnih bolezni, ki so definirane s skupino specifičnih vedenjskih in psiholoških znakov. Pri vseh so prisotni pretiran strah, skrb in izogibanje določenim situacijam ali objektom, brez prisotnosti prave nevarnosti. Anksioznost je karakterizirana s spektrom kognitivnih (npr. težave pri koncentraciji, strah pred izgubo nadzora, strah pred smrtjo), fizioloških (npr. mišična napetost, potenje, težave pri spanju, povišan srčni utrip, težave z dihanjem, slabost, vročinski vali, tresavica, mišična utrujenost, nemirnost) in vedenjskih (npr. izogibanje določenim situacijam in stimulusom) simptomov. Najpogostejše anksiozne motnje, vključene v peti izdaji »Diagnostičnega in statističnega priročnika duševnih motenj« (DSM-IV, ang. The diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition), so ločitvena anskiozna motnja, selektivni mutizem, specifična fobija, socialna anksiozna motnja, panična motnja, agorafobija in generalizirana anksiozna motnja. Vedenjski in fiziološki znaki strahu in anksioznosti niso prisotni le pri ljudeh, ampak jih lahko opazimo tudi pri številnih drugih živalskih vrstah, vključno pri miših. Uporaba laboratorijskih miši za raziskovanje anksioznosti je bistvenega pomena, saj nam omogoča preučevanje patologije in vpletenih mehanizmov anksioznih motenj, ki jih ni možno preučevati pri ljudeh. Kljub nekaterim anatomskim in funkcionalnim razlikam, ki obstajajo med mišmi in ljudmi, so z anksioznostjo povezana subkortična možganska področja, vključno s hipotalamusom in amigdalo, evolucijsko zelo ohranjena. Živčni prenašalci in sistemi, vpleteni v procesiranje anksioznosti, so vsaj v prej omenjenih možganskih regijah med vrstama funkcionalno homologni. Prav tako so si vedenjski in fiziološki odzivi anksioznosti pri miših in ljudeh zelo podobni. Pri obeh vrstah se pojavijo povišani krvni tlak in srčni utrip, mišična napetost, izogibanje grožnji ali potencialno nevarni situaciji, otrpnjenje, boj ali beg odziv, uriniranje in defekacija. Za preučevanje anksioznosti se uporabljajo številne vedenjske paradigme, vključno s testom odprtega območja, testom dvignjenega prekrižanega labirinta, svetlo/temnim raziskovalnim testom in testom socialne interakcije. Pomembno je poudariti, da pri uporabi vedenjskih testov anksioznosti merimo le z anksioznostjo povezane parametre, kot so vedenjski in fiziološki iv odzivi (npr. izogibanje grožnji, aktivnost miši v določenih prostorih, uriniranje/defekacija), in da določenih aspektov človeške anksioznosti pri živalih ne moremo meriti (npr. občutek žalosti in samomorilne misli). Torej, s testi anksioznosti opazujemo in merimo le z anksioznostjo povezano vedenje in ne same anksioznosti. Nedavna analiza sekvenciranja RNA na ravni ene celice, narejena na področju hipotalamusa mladostne miši (postnatalni dan 14-28), je razkrila novo podskupino dopaminskih nevronov, ki se nahajajo v periventrikularnem jedru hipotalamusa. Omenjena podskupina periventrikularnih dopaminskih nevronov (»PeVNd«), je prisotna tudi v hipotalamusu odrasle miši in človeka, vendar je njihova vloga do sedaj še nepoznana. Živčna vlakna nevronov »PeVNd« projicirajo v amigdalo (neobjavljeni rezultati gostiteljskega laboartorija), zato predvidevamo vlogo omenjenih nevronov v regulaciji anskioznosti. Cilji te magistrske naloge so a) določiti izvor nevronov »PeVNd« v možganih mišjih zarodkov, b) ugotoviti lokacijo in migracijski vzorec nevronov »PeVNd« med zarodnim in zgodnjim postnatalnim mišjim razvojem, c) preveriti prisotnost nevronov »PeVNd« v človeškem zarodnem tkivu in d) raziskati vlogo nevronov »PeVNd« pri pojavu anksioznega vedenja pri miših. Za dosego ciljev so bile uporabljene različne metode, vključno z in utero eletroporacijo, imunohistokemijo, in vivo metodami z gensko spremenjenimi mišmi ter vedenjskimi testi anksioznosti. Z uporabo in utero electroporacije, ki smo jo izvedli na mišjih zarodkih, smo uspeli fluorescentno označiti del populacije predniških celic (ang. progenitor cells), ki objemajo steno tretjega ventrikla v hipotalamusu. Z elektroporacijo smo uspeli označiti le predniške celice v dorzalnem predelu tretjega ventrikla, zato na podlagi sedanjih rezultatov ne moremo zaključiti, ali nevroni »PeVNd« izvirajo iz hipotalamične nevrogenske cone (ang. neurogenic niche). Imunohistokemijo smo uporabili za vizualizacijo nevronov »PeVNd« pri embrionalnem in postnatalnem razvoju mišjih možganov. Pokazali smo, da so ti nevroni pri miših prisotni že v zelo zgodnjem razvojnem obdobju, pri embrionalnem dnevu 9.5-10.5. Prav tako smo pokazali, da so od embrionalnega dneva 14.5 dalje omejeni na področje periventrikularnega jedra v hipotalamusu. Immunohistokemijo smo prav tako izvedli na možganskem tkivu človeških zarodkov. Zaradi časovnih omejitev smo izvedli le preliminarne eksperimente, zato trenutno ne moremo potrditi prisotnosti nevronov »PeVNd« med razvojem človeškega zarodka. Kljub časovni omejitvi, ki nam je prepreči.a raziskati vlogo nevronov »PeVNd« v anksioznosti, sem uspela izvesti metodološko podoben eksperiment, ki mi je omogočil, da sem se naučila pravilno izvesti stereotaksično injekcijo in behaviouristični test.

• Language: English
• Keywords: anxiety, hypothalamus, “PeVNd” neurons, periventricular nucleus
• Work type: Master's thesis/paper
• Typology: 2.09 - Master's Thesis
• Organization: PEF - Faculty of Education
• Publisher: [M. Zupančič]
• Year: 2019
• Number of pages: IX, 58 f.
• PID: 20.500.12556/RUL-143581
• UDC: 616.89-008.441:165.194(043.2)
• COBISS.SI-ID: 135476995
• Publication date in RUL: 12.01.2023

Secondary language

• Language: Slovenian
• Title: Razvoj dopaminergičnih hipotalamičnih nevronov in njihova vloga pri pojavu anksioznega vedenja pri miših

Abstract

Anxiety by itself serves as an adaptive and necessary response to threat. However, when it becomes disproportionate and persistent, it may lead to development of anxiety disorders. The lifetime prevalence of anxiety disorders is as high as 28% in adults, which makes them one of the most common psychiatric ailments. Anxiety disorders have both biological and environmental basis, however their complete pathology is so far still not explored. Due to the anatomical similarities and comparable behavioural responses, anxiety-like behaviour and its underlying mechanisms are often studied using animal models, most often rodents. Subcortical brain areas, including the hypothalamus and amygdala, as well as neurotransmitter systems involved in anxiety, are in mice and humans highly similar. Previous research done on transgenic animals and dopamine related diseases has linked dopaminergic signalling as one of the neurotransmitter systems implicated in anxiety-like behaviour. Single cell transcriptome data of the hypothalamic area in the juvenile mouse revealed a novel subgroup of dopaminergic neurons (“PeVNd” neurons), located in the periventricular nucleus of the hypothalamus. They are also present in the periventricular nucleus of the adult human brain. Their axonal projections terminate, among other regions, in the amygdala, thus their involvement in anxiety-like behaviour is considered. The aims of this thesis are to investigate the presence and location of hypothalamic “PeVNd” neurons in embryonic mouse and human fetal tissue, determine their birth place and furthermore explore their involvement in anxiety. Using in utero electroporation technique, performed on mouse embryos, we were able to fluorescently label a subpopulation of hypothalamic progenitors, lining the wall of the third ventricle. Due to methodological limitations the electroporation was limited to the dorsal part of the hypothalamus, thus we were at this point unable to confirm this hypothalamic neurogenic niche as the birth place of “PeVNd” neurons. We performed immunohistochemistry on mouse tissue of different developmental stages to investigate the presence and location of “PeVNd” neurons. By tracing their migratory routes from very early embryonic time-point to neonatal stages, we show that these neurons are in the mouse brain present already at embryonic day 9.5-10.5, and are by embryonic day 14.5 confined to the periventricular space of the hypothalamus. So far, with our initial experiments we were not able to confirm the presence of “PeVNd” neurons during human fetal development. We need to perform further experiment and, if possible, obtain additional samples. Due to the time limitations, we were so far not able to investigate the role of “PeVNd” neurons in relation to anxiety. We were only able to test a methodologically similar experimental design, of which we show our preliminary results. After establishing this technique, we will use it for future experiments involving in vivo manipulation of “PeVNd” neurons.

• Keywords: anksioznost, hipotalamus, nevroni »PeVNd«, periventrikularno jedro, Kognitivna znanost