Krožne RNK uvrščamo v družino nekodirajočih RNK, ki nastanejo v procesu povratnega spajanja. Pri procesu povratnega spajanja prihaja do povezovanja akceptorskega 5' in donorskega 3' konca prepisa, kar omogoči nastanek kovalentno zaprte strukture v obliki kroga. Krožne RNK so bile prvič opažene pred več kot 40 leti, vendar jim raziskovalci niso namenjali veliko pozornosti, saj so mislili, da so krožni prepisi le posledica nepravilnega spajanja eksonov pri procesu dozorevanja prekurzorske mRNA (pre-mRNA). Poleg tega so bile številne krožne RNK zaradi odsotnosti poliadenilacijskega repa na 3' koncu spregledane pri uporabi RNK sekvenciranja. V zadnjih letih je kot posledica razvoja različnih tehnologij in bioinformatskih orodij prišlo do odkritja ogromnega števila krožnih RNK v različnih organizmih, vključno s človekom. Zaradi tega se je pojavilo vprašanje, ali so krožne RNK resnično le posledica napak v spajanju eksonov ali imajo pomembnejšo vlogo v celični biologiji. Intenzivno raziskovanje teh kovalentno zaprtih prepisov je pokazalo, da so ti veliko bolj stabilni v primerjavi z linearnimi RNK. Poleg tega se v določenih primerih pojavljajo celo pogosteje kot njihovi linearni dvojniki in je njihovo izražanje tkivno ter razvojno specifično, hkrati pa se pojavljajo tudi pri različnih živalskih vrstah, kar nakazuje na njihovo evolucijsko ohranjenost.
Številne raziskave namigujejo na prisotnost in vlogo krožnih RNK pri različnih boleznih, vključno z nevrološkimi in kardiovaskularnimi boleznimi ter rakom. Eksperimentalne analize dokazujejo, da so določene krožne RNK vključene v številne poti v celici, vključno z različnimi signalnimi potmi, kot sta PI3K/AKT in mTOR signalna pot, katerih deregulacija je dokazano vključena v nastanek in razvoj raka. Krožne RNK delimo na več tipov glede na njihovo strukturo: eksonske, intronske in ekson-intronske krožne RNK. 80 odstotkov vseh krožnih RNK predstavljajo eksonske RNK, medtem ko se ostala dva tipa pojavljata v manjšem odstotku. V skladu z vrsto krožne RNK se pojavlja tudi več možnih modelov biogeneze krožnih prepisov. Krožne RNK najpogosteje nastanejo v procesu direktnega povratnega spajanja, kjer med izrezovanjem pre-mRNA pride do takojšnega nastanka krožnih RNK. Zelo pogosto se pojavlja tudi t. i. lariatni model, kjer pri obdelavi pre-mRNA pride najprej do nastanka lariatnega intermediata z ostankom preskočenih eksonov, ki se nato povratno spoji in tvori zrelo krožno RNK. Do nastanka intronske RNK lahko pride tudi, ko se normalno izrezani introni ne razgradijo in tvorijo krožno strukturo.
Za nastanek krožnih RNK sta nujno potrebna RNK polimeraza II in izrezovalno-povezovalni kompleks. Poleg tega je regulacija odvisna tudi od cis in trans regulatornih elementov. Med cis elemente regulacije povratnega spajanja pogosto vključujemo ponavljajoče se elemente, kot so na primer ALU ponovitve v primatih. Med trans elemente pa vključujemo proteine, ki se vežejo na molekule RNK (RNK vezavni proteini). Ti proteini ob vezavi na prepis RNK omogočijo stabilizacijo povratnega spajanja in s tem nastanek kroga.
Krožne RNK imajo lahko različne funkcije v celici, vključno s titracijo mikro RNK in vezavo z RNK vezavnimi proteini. Poleg tega lahko krožne RNK uravnavajo izražanje svojih starševskih genov preko interakcij z RNK polimerazo II v jedru ali preko vpliva na DNK hipometilacijo v CpG otočkih promotorja. Kljub temu da krožne RNK uvrščamo med nekodirajoče RNK, pa je bilo ugotovljeno, da imajo številni krožni prepisi tudi sposobnost prevajanja v proteine in peptide.
Vloge krožnih RNK se intenzivno raziskujejo v različnih patofizioloških stanjih, saj je bilo pogosto opaženo njihovo prekomerno ali prenizko izražanje pri različnih boleznih. Na tej točki je potrebno pojasniti, da razlika v izražanju še ne pomeni nujno tudi korelacije z razvojem bolezenskega stanja, ampak so lahko krožne RNK tudi posledica bolezni. Zaradi tega je nujno potrebna natančna opredelitev vloge krožnih RNK v različnih stanjih. Krožne RNK se prav tako intenzivno raziskujejo zaradi njihove potencialne uporabe v kliniki kot diagnostični ali/in prognostični biooznačevalci ter kot terapevtiki. Lastnosti, zaradi katerih bi lahko bili krožni prepisi dobri pokazatelji različnih bolezenskih stanj, med drugim vključujejo njihovo visoko stabilnost, specifično izražanje v tkivih in določenih razvojnih stanjih ter pojavljanje v različnih (lahko dostopnih) telesnih tekočinah, kot sta kri in urin. Poleg tega so krožne RNK zaradi svoje vloge v različnih signalnih poteh zelo zanimive tudi kot terapevtske tarče ali celo kot terapevtske molekule.
Trenutno se uporabljajo številne tehnike za preučevanje krožnih prepisov, vključno z visokozmogljivim sekvenciranjem krožnih RNK, prenosom northern, verižno reakcijo s polimerazo in fluorescenčno in situ hibridizacijo. Vse naštete metode pa se srečujejo z omejitvami pri preučevanju krožnih prepisov. Na primer fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH) ne omogoča opazovanja živih celic in s tem preučevanja celotnega življenjskega cikla krožnih RNK. Poleg tega je težavno tudi načrtovanje sond, ki se morajo vezati na specifično spojitveno sekvenco. Težava se pojavi tudi pri razlikovanju med krožnimi in linearnimi RNK, saj imajo pogosto podobno sekvenco.
Opazovanje krožnih prepisov v fiksiranih celicah je statično, kar pomeni, da je opazovanje možno le v določeni časovni točki v celici. Za boljše razumevanje funkcije krožnih RNK je tako pomembno, da so opazovane dinamično, torej v živih celicah, in širšem časovnem obdobju. Razviti so že številni načini, kako opazovati molekule RNK v živih celicah, ki pa se najpogosteje uporabljajo pri opazovanju mRNK. mRNK namreč sodi med ene izmed najbolj raziskanih molekul RNK, zato je rezultate dinamičnega opazovanja v živi celici enostavneje interpretirati v primerjavi z ostalimi oblikami molekul RNK. Načini, kako opazovati molekule RNK, vključujejo izkoriščanje naravnih interakcij, ki se lahko tvorijo med proteini in RNK. V tem primeru se RNK vezavni proteini, spojeni s fluorescenčno komponento, vežejo na tarčno RNK in na ta način omogočijo označevanje. Med te sisteme vključujemo sistema MS2 in PP7, ki temeljita na bakteriofagnih plaščnih proteinih, ki se vežejo na, s tarčnim proteinom označeno, preučevano molekulo RNK. Alternativa temu pristopu je označevanje RNK molekul s specifičnimi fluorescenčnimi RNK aptameri. Aptameri sicer niso sposobni samostojnega fluoresciranja, temveč ob dodatku specifičnega barvila omogočajo njegovo vgradnjo v svojo tridimenzionalno strukturo. Ta interakcija nato omogoči emisijo fluorescenčne svetlobe. Razviti so bili že številni takšni aptameri, vključno s t. i. »Vegetables« in »Peppers«, ki se uporabljajo predvsem za označevanje mRNK, vendar bi lahko njihovo uporabo prilagodili tudi za preučevanje drugih prepisov, tudi krožnih RNK. »Peppers« RNK aptameri so sposobni izražanja fluorescence, ko pride do vgradnje specifičnega barvila, imenovanega HBC, v njihovo strukturo. Ta vgradnja je možna zaradi ugodnih energijskih interakcij med aptamerom in barvilom. V primerjavi z »Vegetables« imajo »Peppers« boljše spektroskopske in biokemične lastnosti ter hkrati povzročijo zelo malo motenj v normalni biologiji označenih RNK. Zaradi teh lastnosti so skoraj popolni kandidati za preučevanje RNK, vključno s krožnimi RNK v živih celicah.
V sklopu magistrske naloge smo razvijali novo metodo, ki bo ob ustrezni optimizaciji in validaciji omogočila sledenje krožnih RNK v živih celicah. Metoda temelji na fluorescenčnem označevanju različnih krožnih RNK s pomočjo znanih fluorogenih aptamerov RNK (»Peppers«). Ideja metode je v razpolovitvi fluorogenega aptamera na vsako stran linearnega transkripta, ki potem samo v primeru povratnega spajanja spet tvori celoto tj. funkcionalen RNK aptamer. Na ta način smo lahko selektivno označili ektopično izražene ali endogene krožne RNK, ne pa linearnih RNK. Označene krožne RNK smo lahko po dodatku fluorescentnega barvila opazovali v živih celicah pod fluorescenčnim mikroskopom.
Za validacijo in razvoj nove metode smo izvedli številne eksperimente, s katerimi smo želeli potrditi koncept nove metode. Pripravili smo ekspresijski vektor, v katerega smo klonirali razcepljen 4Pepper aptamer RNK. V vmesni predel smo nato klonirali zapise za različne krožne RNK, vključno s FOXO3, HIPK3 in EIF3J. Tako pripravljene konstrukte smo nato vstavili v različne celične linije (HeLa, HEK 293 T in NIH/3T3) z uporabo različnih transfekcijskih reagentov (Dharmafect, Lipofectamine 3000, PEI in MIRUS LT-1). Transfecirane celice smo nato po dodatku HBC barvila opazovali pod fluorescenčnim mikroskopom. Za validacijo izražene fluorescence smo vključili tudi negativne kontrole, ki so vključevale krožno RNK brez oznake, nespremenjene celice s transfekcijskim reagentom in krožne RNK brez introna, potrebnega za cirkularizacijo. Fluorescenčni signal smo kvantificirali glede na število celic, ki so fluorescirale. Dobljene rezultate smo nato primerjali z že objavljenimi izsledki FISH eksperimentov v literaturi. Poleg tega smo prisotnost sekvence na stičišču koncev, ki nastane le ob nastanku kroga, preučevali z uporabo verižne reakcije s polimerazo.
Verjetno najpomembnejša in najbolj uporabna lastnost nove metode fluorescenčnega sledenja krožnih RNK je ta, da je metoda neodvisna od sekvence na stičišču koncev RNK, s čimer ta sekvenca ni več edina unikatna sekvenca v krožnih transkriptih. Hkrati pa nova metoda omogoča tudi in vivo sledenje krožnih RNK brez predhodne fiksacije celice. Zaradi teh lastnosti metoda preseže pomanjkljivosti metode RNK-FISH kot sta fiksacija celic in možnost neuspešne detekcije zaradi omejitve na kratko sekvenco na stičišču koncev RNK. Z eksperimentalnim delom smo uspeli pokazati, da dodatek aptamera RNK sekvenci krožnih RNK ne moti njihove tvorbe. Poleg tega lahko razcepljen aptamer RNK tvori celoto hkrati s tvorbo spojitvene sekvence krožnih RNK in z dodatkom ustreznega fluorescenčnega barvila omogoča opazovanje krožnih RNK z uporabo fluorescenčnega mikroskopa. Za dokaz uporabe nove metode za sledenje krožnih RNK v živih celicah pa bi jih morali opazovati v določenem časovnem obdobju, kar je naslednji korak v razvoju nove metode. Sledenje krožnih RNK v živih celicah je pomembno za preučevanje njihovega mesta delovanja preko opazovanja razporeditve krožnih prepisov v jedru in citoplazmi ter preučevanje njihovega nastanka in funkcije v celici. Z ustrezno optimizacijo lahko ta metoda omogoča uspešno preučevanje biologije krožnih RNK.
|
