Razvoj na antibiotike odpornih sevov bakterij predstavlja resno grožnjo in breme za zdravstveni sistem. Od odkritja penicilina so bile razvite številne protimikrobne spojine. Ker pa so bakterije živi organizmi, imajo sposobnost prilagajanja in tako razvijejo odpornost. Čeprav gre za globalni svetovni problem, je razvoj novih protimikrobnih spojin precej redek. V zadnjih letih so predmet raziskav zlasti novi pristopi pri zdravljenju okužb, ki jih povzročajo odporni sevi, kot je terapija s fagi. Ta pristop lahko prinese dobre rezultate, vendar je za razvoj in sprejetje takšne terapije v praksi potrebnega kar nekaj časa. Trenutno uporabljene antibiotike razdelimo v 9 strukturnih skupin (beta laktamski antibiotiki, cefalosporini, aminoglikozidi, makrolidi, tetraciklini, sulfonamidi, fluorokinoloni, linkozamidi in ostale strukturne skupine), novi antibiotiki pa v glavnem temeljijo na modifikaciji doslej znanih struktur. Antibiotik kanamicin, uporabljen kot negativna kontrola v delu, pripada skupini aminoglikozidov.
Bakterije se na različne načine zaščitijo pred protimikrobnimi snovmi. Najbolj znani načini delovanja bakterijske odpornosti so sprememba tarče antibiotika, proizvodnja encimov, ki spreminjajo ali razgrajujejo antibiotik, zmanjšanje prepustnosti antibiotikov v celico zaradi strukturnih sprememb porina in aktivno izločanje antibiotikov iz bakterijskih celic. Nekatere bakterije so naravno odporne na določene spojine, če nimajo ustreznih vezavnih mest, kar je primarna bakterijska odpornost. Vendar so mutacije med bakterijami pogoste in lahko povzročijo novo odpornost. Ko govorimo o odpornosti, je pomembno omeniti nastanek biofilma. Nastanek biofilma je naravna lastnost večine bakterijskih vrst in je najpogostejša oblika, v kateri jih najdemo v okolju. Biofilm je kompleksna struktura, sestavljena iz živih in odmrlih bakterij, ujetih v zunajcelični matriks, sestavljen iz različnih polimernih molekul, ki so presnovni produkti bakterij znotraj biofilma. Primeri takšnih polimernih molekul so eksopolisaharidne snovi, beljakovine in nukleinske kisline, sproščene iz odmrlih bakterij. Te strukture bakterijam zagotavljajo mehansko zaščito, poleg tega pa bakterije v biofilmu komunicirajo z uporabo signalnih molekul. Zaradi zgoraj naštetega, pravila klasične mikrobiologije pogosto niso uporabna za biofilm. Koncentracije, potrebne za zaviranje rasti bakterij v biofilmu, pa so pogosto bistveno višje od tistih, ki veljajo za planktonske bakterijske celice.
V delu smo preizkusili protimikrobne lastnosti sto različnih spojin, ki so bile na voljo v knjižnicah spojin Katedre za biokemijo in Katedre za organsko kemijo Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Ljubljani. Spojine so bile testirane na dveh Gram-pozitivnih vrstah (Staphylococcus aureus in Bacillus thuringiensis) ter dveh Gram-negativnih vrstah (Escherichia coli in Pseudomonas aeruginosa). Vse seve smo dobili od izr. prof. dr. Mateja Butale z Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Navedene vrste, razen B. thuringiensis, so čez zgodovino razvili odporne seve in so zato zanimiv predmet raziskave. Poleg tega so tako divji kot tudi mutirani odporni sevi pogosti izolati v klinični praksi. Ker se število razpoložljivih učinkovitih antibiotikov sčasoma in z razvojem mutacij zmanjšuje, je treba razviti nova protimikrobna sredstva in nove pristope k zdravljenju okužb, ki jih povzročajo odporni sevi.
Tako je med odpornimi Gram-pozitivnimi znan Staphylococcus aureus, odporen na meticilin (MRSA), medtem ko se pri Gram-negativnih bakterijah pojavljajo sevi ESBL (beta laktamaza razširjenega spektra, angl. extended spectrum beta-lactamase), odporni na novejše generacije cefalosporinskih antibiotikov. Sevi ESBL so, med ostalim, prisotni pri vrstah Escherichia coli in Pseudomonas aeruginosa.
Namen te raziskave je bil preveriti, ali imajo izbrane organske spojine protimikrobne lastnosti proti izbranim sevom bakterij. S spojinami, ki so delovale protimikrobno, smo določili rastne krivulje in minimalne inhibitorne koncentracije. To delo predstavlja začetek sistematičnega raziskovanja protimikrobnega delovanja sintetiziranih organskih spojin iz omenjenih knjižnic na rast bakterij in bi moralo zagotoviti podlago za prihodnje raziskave. Naši hipotezi sta bili, da (1) v knjižnici obstajajo spojine s protimikrobnim učinkom, in (2) da se njihov učinek na testirane bakterijske vrste razlikuje.
Zaviranje rasti smo spremljali z gojenjem bakterij do eksponentne faze rasti, kar pomeni 16 do 18 ur oz. preko noči, v prisotnosti oz. odsotnosti testiranih spojin. Bistre raztopine po inkubaciji so bile pokazatelj možnega zaviralnega učinka testiranih spojin. Rezultate smo potrdili še spektrofotometrično z merjenjem absorbance pri 600 nm. Vse spojine smo testirali pri koncentraciji 100 μg/mL. Pozitivno kontrolo so predstavljale bakterije gojene v tekočem LB gojišču brez dodane spojine, kot negativno kontrolo smo uporabili dodatek antibiotika kanamicina, ki zavira rast vseh preučevanih bakterij. Kot slepi vzorec smo uporabili samo LB gojišče ter vrednosti absorbance odšteli od absorbanc vzorcev s testnimi spojinami. V primerih obarvanih spojin je slepi vzorec predstavljalo gojišče LB z dodano spojino. Spojine, ki se kazale zaviranje bakterijske rasti, smo dodatno testirali s prilagojeno Kirby-Bauerjevo difuzijsko metodo, kjer smo na trdno gojišče z nacepljenimi bakterijami položili sterilni celulozni disk, nanj odpipetirali 10 μL koncentrirane preučevane spojine (20 mg/mL) in po 24-urni inkubaciji preverili prisotnost in velikost cone inhibicije, ki je potrdila zaviralni učinek. V primeru potrditve zaviralnega učinka smo naredili razredčitve antibiotikov in določili najmanjšo inhibitorno koncentracijo (MIC). Med preizkušenimi spojinami je devet spojin kazalo protimikrobno delovanje, od katerih smo dve podrobneje okarakterizirali, in sicer 2-[(4-kloro-1-hidroksinaftalen-2-karbonil) amino] -2-metilpropanojska kislina (spojina 1) in piperidin-2-il-{2-(trifluorometil)-6-[4- (trifluorometil) fenil] piridin-4-il} metanol tudi znana kot enpirolin (spojina 2). V prisotnosti spojine 2 smo izmerili krivulje rasti, tako da smo spremljali rast bakterij v časovnem obdobju 6 ur, kjer so bakterije prišle v osrednji del ekponencialne fazi rasti (za vse izbrane vrste je vrednost A600 kontrole iznaša med 0,6 in 0,8). Pri dodatku spojine 2 in pri negativni kontroli rast nobene od preučevanih bakterij ni bila opazna oz. vrednost A600 je bila blizu nič.
Čeprav smo pri spojinah 4 (1-hidroksi-2,2,2-trikloroetil)urea) in 5 (N,N-dimetiletilenamin-4-metilenamin piperidin) opazili zaviralni učinek na rast bakterij, se je izkazalo, da imajo same spojine visoke vrednosti absorbance slepih vzorcev. Po Kirby-Bauerjevi difuzijski metodi preskušanja občutljivosti bakterij na ti dve spojini območja inhibicije v nobenem primeru nismo opazili, zato sklepamo, da spojini nimata dejanskega zaviralnega učinka. Spojina 6 (N2-cikloheksil-N1-(6-metoksi-8-kinolinil)-1,2-butandiamin) je selektivno zavirala rast S. aureus. Pri preizkušanju občutljivosti z difuzijsko metodo smo izmerili območje inhibicije 12 mm. Spojina 7 (derivat pirazola, sintetiziran na Katedri za organsko kemijo) je selektivno zavirala rast P. aeruginosa, njeno protimikrobno delovanje pa je treba še potrditi z dodatnimi testi in podrobneje preučiti.
Spojina 1 je pokazala selektivni protimikrobni učinek le na S. aureus z najmanjšo inhibitorno koncentracijo 125 µg/mL, medtem ko je spojina 2 zavirala rast vseh testiranih sevov. Najnižje inhibitorne koncentracije spojine 2 za S. aureus in B. thuringiensis so bile 88 µg/mL, za E. coli 175 µg/mL in za P. aeruginosa 316 µg/mL. Za spojino 2 smo pripravili rastne krivulje v njeni prisotnosti in odsotnosti in v obdobju 6 ur spremljali rast bakterij. V opazovanem obdobju ni bilo povečanja števila bakterij v prisotnosti spojine.
Spojina 1 se je izkazala zanimivo, zaradi selektivnega zaviralnega učinka. Zaradi majhne količine razpoložljive spojine ni bilo mogoče izvesti podrobnejših raziskav. Zato smo morali za nadaljnje eksperimente sami sintetizirati zadostno količino te spojine. Sinteza spojine 1 je razmeroma preprosta in poteka iz po dveh reaktantov (4-kloro-1-hidroksinaftalenkarboksilna kislina in 2-metilpropanojska kislina) in pomožnih snovi (karbodiimid, hidroksibenzotriazol hidrat in N-metilmorfolin). Ker reaktanti za sintezo spojine 1 niso bili na voljo na Katedri za organsko kemijo, smo se odločili za sintezo njenega analoga (metilni ester [(2-hidroksinaftalen-1-karbonil) amino]-2-metilpropanojske kisline, spojina 8), ki se od spojine 1 razlikuje po položaju hidroksilne skupine in odsotnosti atoma klora, vezanih na naftalenski obroč, ter po dodatku metilnega estra, vezanega na aminokislinski del molekule. Novo sintetizirano spojino smo očistili na koloni s silika-gelom, čistost frakcij pa smo preverili s tankoplastno kromatografijo. Čiste frakcije smo združili in jih uparili. Po sintezi smo pregledali strukturo in čistost sintetiziranega analoga z NMR spektroskopijo. 1H-NMR spekter je pokazal, da mso sintetizirali 287 mg čiste spojine z videzom rumenega prahu.
Nato smo preučili inhibitorni učinek spojine 8 in ugotovili, da sicer nekoliko zavira rast vseh testiranih sevov, vendar je bilo zaviranje v vseh primerih manjše od 50%. Vzporedno s smo testirali tudi reaktanta, uporabljena pri sintezi, in sicer, 2-hidroksi-1-naftojsko kislino (HNA, spojina 9) in metilni ester 2-amino-2-metilpropanojske kisline. Spojina 9 je pokazala zaviralni učinek (> 90 % zaviranje rasti) na S. aureus in E. coli. Spojina 1 in spojina 9 imata enako ogrodje, kar kaže, da je za zaviranje ključen tisti del, ki je obema molekulama skupen. Razlog za neučinkovitost spojine 8 v primerjavi s spojinama 1 in 9 bi lahko bila večja velikost molekule na račun metilestrske skupine v aminokislinskem delu molekule. Spojina 9 je sestavni del naftalenskega dela spojine 8. Iz tega sklepamo, da je ključ za selektivno zaviranje rasti S. aureus bodisi hidroksilni del molekule spojine 9, ki se v spojini 8 izgubi zaradi tvorbe amidne vezi z 2-amino-2-metilpropanojsko kislino ali zaradi dodatka metilnega estra, ki je lahko med reakcijo s ciljnimi bakterijskimi strukturami sterična ovira. Zaradi podobnosti z antibiotikom rifampicinom domnevamo, da bi bil mehanizem delovanja spojin 1 in 9 na S. aureus lahko podoben, torej da se veže na β podenoto bakterijske RNA-polimeraze. Vendar pa so potrebne nadaljnje raziskave, da bi ugotovili natančno povezavo med strukturo in aktivnostjo ter določili mehanizem delovanja.
Rezultati te magistrske naloge tako predstavljajo izhodišče za obsežnejše biokemijske in molekularnobiološke raziskave učinkov in mehanizmov doslej neraziskanih spojin iz knjižnice spojin FKKT na zaviranje rasti bakterij.
|
