Bioinformatična analiza podatkov, pridobljenih na mišjem modelu prionske bolezni z metodo RiboTag in vzpostavitev celične linije za njeno vrednotenje

Koderman, Maruša (author), Karas Kuželički, Nataša (mentor), Kaczmarczyk, Lech (co-mentor)

Globalni trend staranja prebivalstva s seboj prinaša številne izzive na področju zagotavljanja zdravstveno-socialne varnosti. Med njih sodi tudi naraščanje incidence nevrodegenerativnih bolezni, ki trenutno veljajo za neozdravljive. Posebno skupino nevrodegenerativnih bolezni predstavljajo prionske bolezni oz. transmisivne spongiformne encefalopatije, ki jih povzročajo prioni – infektivni delci v celoti sestavljeni iz napačno zvite oblike endogenega prionskega proteina, ki se v večji meri izraža na površini celic centralnega živčnega sistema. Prva oblika prionske bolezni imenovana praskavec je bila odkrita pri drobnici, za najbolj zloglasno pa velja prionska bolezen govedi, poznana tudi kot bolezen “norih krav”. Pri ljudeh glede na etiologijo ločimo pridobljene, dedne in sporadične prionske bolezni. Vsem je skupna značilna histopatološka slika z vakuolizacijo sive možganovine, ki daje tkivu prepoznaven gobast videz. Tako kot pri številnih drugih nevrodegenerativnih boleznih so tudi pri prionskih boleznih patološke spremembe sprva omejene le na določen predel možganov, kar je razlog za njihovo fenotipsko raznolikost. Mehanizem tega pojava, ki ga imenujemo selektivna dovzetnost, ostaja neznan. Ključnega pomena za njegovo razumevanje je obravnava molekulskih sprememb na ravni posameznih možganskih predelov in celic. Pri tem igrajo pomembno vlogo metode, ki omogočajo pridobitev celično specifičnih podatkov o spremembah v genskem izražanju. Med njih sodita metodi RiboTag in TRAP (angleško translating ribosome affinity purification), ki si delita osnovni koncept in vivo epitopskega označevanja ribosomalnih proteinov s pomočjo mišje mutageneze. To omogoča izolacijo na ribosome vezanih mRNA molekul (translatom), ki v primerjavi s celotno mRNA bolje odražajo proteinsko sestavo celice. S sekvenciranjem nove generacije lahko te molekule natančno okarakteriziramo in s tem pridobimo vpogled v spremembe, ki se kot odgovor na različne dražljaje odvijajo v določeni celični populaciji. Tovrsten pristop je ustrezen predvsem pri obravnavi patoloških stanj, katerih mehanizem redko vključuje le spremembe posameznih celičnih komponent. Te so namreč del interaktoma – kompleksne mreže molekulskih interakcij, ki ponazarja medsebojno odvisnost celičnih procesov. Preučevanje interaktoma na podlagi teorije grafov omogoča boljše razumevanje bolezni, kar predstavlja osnovo za iskanje novih terapevtskih tarč in biomarkerjev. Pogosto je omejeno na mreže, v katerih vozlišča predstavljajo proteine, veje oz. robovi pa fizične povezave med njimi. Proteinske mreže so tako kot številne druge mreže, ki ponazarjajo kompleksne sisteme (npr. svetovni splet), skalno neodvisne. Pomembno strukturno značilnost skalno neodvisnih mrež predstavljajo skupnosti vozlišč, katerih pripadniki med seboj tvorijo več povezav kot s preostalimi mrežnimi elementi. V proteinskih mrežah se v skupnosti, ki jih imenujemo bolezenski moduli, pogosto združujejo proteini povezani z določenim patološkim stanjem. Vozlišča, ki sestavljajo bolezenske module, lahko identificiramo s pomočjo različnih algoritmov. Eden izmed takšnih je DIAMOnD, s katerim vozlišča v bolezenski modul dodajamo postopno, na podlagi signifikantnosti števila njihovih povezav z začetnim setom znanih bolezenskih proteinov. V magistrski nalogi smo mrežni pristop uporabili za preučevanje odgovora različnih možganskih celic na prionsko okužbo. Pri tem smo izhajali iz podatkov, ki so bili pridobljeni v predhodno izvedeni študiji na mišjem modelu praskavca, s pomočjo metode RiboTag. Podatki vsebujejo informacije o spremembah v genskem izražanju pri petih vrstah možganskih celic v dveh časovnih točkah: pred pojavom zaznavnih sprememb možganske aktivnosti in po pojavu bolezenskih znakov. Ker se pri napredovali bolezni možnosti za uspešno terapevtsko intervencijo manjše, smo se osredotočili le na spremembe v prvi časovni točki. Kot izhodišče analize smo uporabili seznam genov s pripadajočimi p-vrednostmi, ki določajo signifikantnost spremembe njihovega izražanja. Pogosto pri razvoju bolezni sodelujejo funkcionalno povezani geni, ki posamezno ne izkazujejo statistične pomembnosti, temveč imajo velik kumulativni učinek. Izbira diferencialno izraženih genov na podlagi arbitrarne mejne p-vrednosti je torej lahko nepopolna. Da bi bolje definirali ključne bolezenske spremembe v zgodnji fazi prionske okužbe, smo gene, katerih izražanje je signifikantno spremenjeno, uporabili kot izhodiščna vozlišča pri iskanju celično specifičnih bolezenskih modulov. Sprva smo v ta namen s pomočjo spletne podatkovne baze STRING izgradili mrežo proteinskih interakcij. Le 50.1 % teh interakcij je podprto z eksperimentalnimi dokazi, večji delež proteinov pa si povezave deli na podlagi sonavedb v znanstveni literaturi. Število povezav, ki si jih določen protein deli z drugimi vozlišči je tako odvisno od tega kako dobro je ta protein raziskan. Morebitna pristranskost do bolje raziskanih proteinov lahko vpliva na identifikacijo vozlišč bolezenskih modulov. Da bi ta vpliv zmanjšali, smo razvili modificirano različico algoritma DIAMOnD, pri katerem je vsakemu kandidatnemu bolezenskemu proteinu/genu pripisan rang glede na število njegovih povezav z izhodiščnimi vozlišči in glede na p-vrednost, ki določa signifikantnost spremembe njegovega izražanja. Gen z najvišjo vsoto obratne vrednosti posameznih rangov se vključi v bolezenski modul. Hkrati sestavlja tudi set izhodiščnih vozlišč v nadaljnjih ponovitvah algoritma. Z uporabo modificirane različice algoritma DIAMOnD smo odkrili bolezenske module treh vrst možganskih celic: astrocitov, GABAergičnih nevronov in glutamatergičnih nevronov. Uspešnost algoritma smo ocenili na podlagi primerjave z osnovnim algoritmom. S slednjim smo identificirali večje število genov, ki si z izhodiščnimi vozlišči delijo funkcionalne značilnosti. Število funkcionalno sorodnih genov je bilo signifikantno tudi v bolezenskih modulih zaznanih z modificiranim algoritmom, ki pa so vsebovali večji delež izhodiščnih vozlišč. Največ genov je bilo vključenih v astrocitni modul, med njimi številni, ki kodirajo komponente dihalne verige. Znižano izražanje teh genov najverjetneje vodi v oksidativni stres in zmanjšano proizvodnjo ATP. Posledično pride do zmanjšane sinteze proteinov in sprememb v procesiranju RNA molekul. Zaradi prionske okužbe lahko pride do porasta prostih kisikovih radikalov tudi v GABAergičnih nevronih. Poleg tega so v teh celicah prisotne spremembe v izražanju genov, ki sodelujejo pri uravnavanju cirkadialnega ritma. Po drugi strani se v populaciji ekscitatornih nevronov aktivirajo nekateri obrambni mehanizmi. Povečano izražanje genov, ki kodirajo citoskeletne proteine npr. pripomore k mehanski stabilizaciji celic in ohranjanju sinaptične plastičnosti. Na podlagi rezultatov mrežne analize lahko sklepamo, da se različne možganske celice na razvijajočo se prionsko bolezen odzovejo drugače. Pravilnost te ugotovitve je med drugim odvisna od učinkovitosti metode RiboTag. Ta omogoča izolacijo mRNA, vezane na ribosome, ki vsebujejo označen ribosomalni protein Rpl22. S tem se RiboTag razlikuje od metode TRAP, pri kateri je epitopski označevalec pripet na ribosomalni protein Rpl10a. Nedavni dokazi, ki pričajo o obstoju ribosomov s specializiranimi funkcijami, kažejo na morebitne razlike v učinkovitosti med metodama. Rpl22 in Rpl10 se lahko namreč prednostno vključujeta v ribosome, ki sodelujejo pri translaciji le določenih mRNA molekul. V magistrski nalogi smo želeli razviti sistem, ki bi omogočal ustrezno vrednotenje te hipoteze. V ta namen smo izdelali dva plazmidna vektorja z zapisom za označena Rpl22 in Rpl10a in ju uporabili za transfekcijo mišjih embrionalnih matičnih celic. Z uporabo sistema CRISPR/Cas9 smo omogočili vstavitev kodirajočih zaporedij za modificirana proteina v lokus Rosa26. Uspešnost tarčnega genskega preurejanja smo preverili z reakcijo PCR.

• Language: Slovenian
• Keywords: RiboTag, translatom, prionske bolezni, gensko preurejanje, heterogenost ribosomov, mreža, bolezenski moduli, celična specifičnost
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2021
• PID: 20.500.12556/RUL-134130
• Publication date in RUL: 24.12.2021

Secondary language

• Language: English
• Title: Bioinformatic analysis of RiboTag translatome profiling data from a mouse prion disease model and establishment of a cell line for RiboTag method evaluation

Abstract

Neurodegenerative diseases are a group of disorders affecting the nervous system that develop as a consequence of protein misfolding and aggregation. These pathological changes affect only specific brain areas and the mechanisms behind this regional preference are unknown. Elucidating the strategies employed by different brain cell types in confronting protein aggregates would lead to a better understanding of this phenomenon, known as selective vulnerability. To facilitate this task, several transgenic tools were developed to study cell-type-specific gene regulation in mice. Among the most notable are RiboTag and TRAP (translating ribosome affinity purification), which rely on epitope-tagging of polysomes (translating ribosomes) for the extraction of ribosome-bound mRNA. Combining RiboTag or TRAP with RNA sequencing provides a genome-wide snapshot of the changes occurring in specific cell populations under various conditions. This strategy is particularly suited for studying pathophysiological states which rarely develop as a consequence of a single gene or protein abnormality. Rather, the cellular events resulting in disease can be viewed as a perturbation of an intricate network of interactions between diverse molecular components. Applying the concepts of graph/network theory to molecular interaction networks can contribute to understanding of disease mechanisms, thereby facilitating drug-target prediction and biomarker discovery. In this thesis, we used a network-based approach to study how different brain cell types respond to a prion disease called scrapie, a fatal neurological disorder caused by misfolding of the endogenous prion protein. Prion disease-related communities within cell-type-specific molecular networks (disease modules) were identified using a modified DIAMOnD algorithm in which information on protein interaction patterns was combined with data from a RiboTag-based gene expression study. We show that the modified algorithm can outperform the original version. Moreover, we reveal that astrocytes, GABAergic neurons, and glutamatergic neurons each face ensuing prion disease with unique changes to gene expression. To verify these results in the context of the recently discovered phenomenon of ribosome specialization, we developed a tool for side-by-side comparison of RiboTag and TRAP technologies. Particularly, we established two murine cell lines using CRISPR/Cas9 which allow for an unbiased comparison of mRNA profiles obtained by both methods.

• Keywords: RiboTag, translatome, prion disease, genome editing, ribosome heterogeneity, network, disease module, cell-type-specificity