Merjenje koncentracij steroidnih hormonov s tekočinsko kromatografijo sklopljeno s tandemsko masno detekcijo v plazmi in mleku mater v povezavi z njihovimi različnimi prehranskimi profili

Trstenjak, Melani (author), Trontelj, Jurij (mentor), Zinser, Erwin (comentor)

Prehrana matere med nosečnostjo predstavljajo edini vir energije za zarodek (razen v primeru stradanja). Po rojstvu otroka pa je najprimernejša hrana za otroka materino mleko, saj vsebuje vse potrebne makro- in mikronutriente ter bioaktivne snovi, ki so nujni za zdravo rast in razvoj otroka. Ustrezna prehrana matere mora torej upoštevati potrebe materinega zdravja, rast in zdravje zarodka oziroma otroka ter pripomore k hitrejšemu okrevanju po porodu. Poleg prehrane pa je pomembno tudi materino splošno počutje in ravnovesje hormonov, še posebej stresnih hormonov. Študije so pokazale, da prav ti dogodki (podhranjenost, prekomerna prehrana, izpostavljenost toksinom, neravnovesja hormonov mater) lahko vplivajo na otrokovo dovzetnost na določene kronične bolezni v odrasli dobi. V magistrski nalogi smo poskušali ugotoviti, kako prehrana mater v nosečnosti vpliva na njihovo sestavo mleka in na koncentracije steroidnih hormonov v mleku in plazmi. Rezultati raziskave bodo pripomogli k boljšemu razumevanju omenjene povezave v projektu o predispoziciji perinatalnega metaboličnega programiranja debelosti. Najprej smo se osredotočili na rezultate vprašalnikov o pogostosti uživanja živil in pijače, ki so jih izpolnile nosečnice v 36. tednu nosečnosti. Obdelali smo podatke o prehranskem vnosu proteinov, ogljikovih hidratov, maščob in energije. Vsem navedenim makronutrientom in energiji smo glede na literaturo postavili najprimernejša referenčna območja za zmanjšan, normalen in povečan vnos ter ustrezno mersko enoto. Ugotovili smo, da je večina nosečnic v študiji imela povečan vnos energije in proteinov glede na potrebe telesa. Vnos ogljikovih hidratov je bil normalen ali zmanjšan, pri vnosu maščob pa so udeleženke v enaki meri zasedle vsa tri območja. Makronutrienti v mleku mater so bili izmerjeni z MIRIS analizatorjem za človeško mleko v dveh časovnih točkah, pri obisku v 8 in v 16 tednu po porodu. Rezultati so bili podani kot g/100 mL mleka, te pa smo prav tako primerjali z rezultati dosedanjih študij. Povprečna vrednost vseh vzorcev za vsak makronutrient je bila primerljiva z literaturo, razen vrednosti ogljikovih hidratov v mleku, ki so bile zelo povišane in neprimerljive z dosedanjimi študijami. Treba je omeniti, da je pri analizah mleka zelo pomemben način odvzema, saj sestava mleka zelo variira glede na čas po porodu (kolostrum ali zrelo mleko), v katerem delu dneva je odvzet, število hranjenj in količino, če gre za nedonošenčke itd. Najprimernejši odvzem je 24-urni, takšnega odvzema pa pri naši študiji ni bilo mogoče izvesti, zato so matere pri vsakem obisku v različnih časovnih točkah iztisnile 20 mL mleka. Temu primerni so bili rezultati, lahko pa rečemo, da je v obeh primerih šlo za zrelo mleko, odvzeto dopoldan. Rezultate sestave mleka smo razdelili v skupine po zmanjšanem/normalnem/povečanem prehranskem vnosu za vsak makronutrient in energijo in s pomočjo programa MetaboAnalyst 5.0 obdelali rezultate. Najboljši prikaz podatkov omogoča hierarhična analiza s toplotnim zemljevidom, iz katere smo lahko razbrali, da prehrana nosečnic in vnos makronutrientov ne vpliva na sestavo mleka. Koncentracije steroidnih hormonov smo določili s tekočinsko kromatografijo sklopljeno s tandemsko masno detekcijo v plazmi in mleku mater. Pri tem smo uporabili že uveljavljeno metodo detekcije, ki smo jo morali prilagoditi zaradi različnih bioloških vzorcev. Za pripravo vzorca smo uporabili podprto tekočinsko ekstrakcijo. Izmerili smo devet steroidnih hormonov, ki spadajo v skupine androgenov, kortikosteroidov in progestogenov. V plazmi smo lahko izmerili vseh devet steroidov, v materinem mleku pa samo kortizon, hidrokortizon (kortizol) in androstendion. Ugotovili smo, da so vrednosti v mleku in plazmi primerljive, kar je prav tako opisano v literaturi. Izmerjene vrednosti steroidnih hormonov so znotraj referenčnih območjih omenjenih v različnih študijah, rezen pri 17α-hidroksiprogesteron, kjer smo imeli znižane koncentracije. Umeritve krivulje so bile pripravljene v območjih od 0,0002 do 100 ng/mL, glede na pričakovane koncentracije posamičnega analita. Pri validaciji metode za plazmo smo dokazali ustrezno točnost, ponovljivost, selektivnost in izkoristek. Pri mleku pa smo imeli več težav z motečimi snovmi v vzorcu in zamašitvijo kolone. Posledično smo imeli slabšo ponovljivost. Točnost, selektivnost in izkoristek so bili še vedno ustrezni. Neustrezne vrednosti so bili tudi pri vplivu ozadja, a zaradi uporabe internega standarda ni vplival na naše meritve. Za konec smo primerjali koncentracije steroidnih hormonov s prehrano mater, kjer smo ponovno razdelili vzorce v tri skupine po prehranskem vnosu. Tudi tokrat smo za boljši pregled podatkov izbrali toplotni zemljevid, iz katerega ni bil razviden noben specifičen vzorec, ki bi namigoval na povezano med prehrano in koncentracijo steroidnih hormonov. Lahko povzamemo, da prehrana nosečnic v zadnjem trimesečju ne vpliva na sestavo zrelega mleka in prav tako ne na koncentracijo steroidnih hormonov kasneje po porodu. Raziskava je pokazala pomembno sposobnost ženskega organizma, ki ohranja zdravo sestavo materinega mleka z normalno koncentracijo steroidnih hormonov, tudi če njena prehrana ni idealno zdrava v smislu vnosa makronutrientov in energije.

• Language: Slovenian
• Keywords: steroidni hormoni, materino mleko, plazma, prehrana mater, LC-MS/MS
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2021
• PID: 20.500.12556/RUL-131346
• Publication date in RUL: 25.09.2021

Secondary language

• Language: English
• Title: Determination of steroid hormones by liquid chromatography - tandem mass spectrometry in breast milk and blood plasma in relation to different nutritional profiles of mothers

Abstract

The woman's diet during pregnancy is the main source of nutrients for the fetus (except in the case of starvation). Later, after the birth of a child, the mother produces breast milk, which contains all the necessary macro- and micronutrients and bioactive factors important for the healthy development and growth of the infant. Studies have shown that maternal events of undernutrition, overnutrition, exposure to toxins, maternal hormone imbalances (especially stress hormones) affect a child's susceptibility to certain chronic diseases in adulthood. In the master's thesis, we tried to find a relation between nutrition during pregnancy and composition of the breast milk as well as concentrations of steroid hormones in milk and plasma of mothers. First, we focused on the results of the food frequency questionnaire completed by pregnant women in the 36th week of pregnancy. We presented the data as dietary intake of protein, carbohydrates, fats, and energy. The most suitable reference ranges were set for all mentioned macronutrients and energy as low, normal, and high intake. Breast milk samples were obtained at 8th and 16th weeks postpartum and macronutrients in these were measured by a MIRIS human milk analyzer. The results of milk composition were divided into groups according to low/normal/high nutritional intake for each macronutrient and energy. For better overview of the data, we performed a hierarchical cluster analysis with heatmap using the program MetaboAnalyst 5.0. From created heatmaps, we were able to deduce that the diet of pregnant women and the intake of macronutrients and energy do not affect the composition of milk. Steroid hormone concentrations were determined by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry in maternal plasma and breast milk. We used the already established quantitation method, but due to different biological samples, we had to modify it and validate it. A supported liquid extraction was used to prepare the samples. We measured nine steroid hormones in maternal plasma and human milk. We found that the values in milk and plasma are comparable. Finally, we investigated the possible influence of maternal diet on steroid hormones concentrations, applying the same intake groups as mentioned before. Once again, for a better overview of the data, we created heatmaps, that visually showed no specific patterns which could suggest a link between diet and steroid hormone concentration of mothers. Our research has shown an unexpected, but very important capability of a woman’s organism – to maintain the healthy composition of breast milk with normal steroid hormone levels even if her diet is not ideally healthy in terms of macronutrient and energy intake.

• Keywords: steroid hormones, breast milk, plasma, maternal nutrition, LC-MS/MS