Priprava in vrednotenje lastnosti mutant porotvornih proteinov stiholizina I in II

Gorše, Ana (author), Lunder, Mojca (mentor), García Linares, Sara (comentor)

Aktinoporini sodijo v skupino porotvornih proteinov, ki jih proizvajajo morske vetrnice iz rodu Cnidaria. Kot večina ožigalkarjev tudi one uporabljajo ožigalne celice oz. nematociste pri plenjenju, in sicer vbodne strukture, ki vsebujejo mešanico toksinov: citolizine (med katerimi so tudi aktinoporini), fosfolipaze in nevrotoksine. Ti remodelirajo celično membrano plena s tvorbo por, kar povzroči osmotsko neravnovesje in posledično celično smrt. Pri manjših rakih in ribah toksini povzročajo tudi bolečino in paralizo, ki je posledica spremenjenega izločanja nevrotransmiterjev v plenu. Velikost aktinoporinov je okoli 20 kDa/175 aminokislin. Ti proteini ne vsebujejo cisteina, zaradi česar niso sposobni tvorbe disulfidnih mostov, in imajo bazični pI, ki je običajno višji od 9. So predstavniki amfitropičnih proteinov in so lahko stabilno zviti v vodnih raztopinah, prav tako pa se lahko vgradijo v membrano, kjer tvorijo pore, specifične za katione, s premerom 1–2 nm. Zaradi te lastnosti predstavljajo optimalen model za proučevanje prehoda iz monomernih vodotopnih proteinov v oligomerne transmembranske skupke. Podrobneje so ovrednotili štiri aktinoporine: stiholizin I in II (iz rodu Stichodactyla helianthus), ekvinatoksin II (EqtII, iz rodu Actinia equina) in fragaceatoksin C (FraC, iz rodu Actinia fragacea). Splošna struktura aktinoporinov vsebuje motiv β–sendviča, sestavljenega iz 10–12 β–verig. Ob straneh se nahajata dve α–vijačnici, izmed katerih se je α1–vijačnica sposobna oddaljiti od preostalega dela proteina, prebosti membrano in tvoriti steno nastale pore. Tako je odgovorna za funkcijo proteina in aktinoporine uvršča med α–porotvorne toksine. β–sendvič in druga α–vijačnica pa sodelujeta v prepoznavanju in vezavi na celično membrano, pri čemer ostane njuna struktura nespremenjena. Mehanizem, po katerem nastanejo pore, je sestavljen iz več korakov: prepoznave sfingomielina, vezave na membrano, prenosa N–končnega dela proteina do mejne površine med vodno fazo in lipidi, oligomerizacije in tvorbe pore. Pri vezavi na membrano imajo ključno vlogo hidrofobne interakcije. Zmožnost nastanka por je pri aktinoporinih odvisna od številnih dejavnikov, izmed katerih velja izpostaviti sestavo in fizikalno–kemijske lastnosti lipidnega dvosloja. Prisotnost holesterola v membrani olajšuje tvorbo por, saj ta sterol fluidizira metilenske stranske verige sfingomielina in skupaj s sfingomielinom tvori mikrodomene. Stiholizin I in stiholizin II imata 93 % identično aminokislinsko zaporedje, kljub temu pa je stiholizin II bolj hemolitično aktiven, še posebej pri uporabi lipidnih modelov s holesterolom, ki pomembno vpliva na njegovo sposobnost tvorbe por. Delo, ki smo ga opravili v okviru magistrske naloge, je sestavljeno iz dveh sklopov. V prvem sklopu smo pripravili štiri cisteinske mutante proteinov stiholizina I (z mutacijo I7C oz. K68C) in stiholizina II (z mutacijo I6C oz. K67C). Določili smo njihovo aminokislinsko zaporedje, izvedli pomnoževanja PCR, izolacijo, restrikcijo ter ligacijo majhnega in velikega dela plazmida, pripravili in uporabili kompetentne bakterije Escherichia coli za izražanje ciljnih proteinov, izolirali posamezne kolonije ter izvedli izolacijo in čiščenje plazmidov. V nadaljevanju raziskav načrtujejo pridobivanje in čiščenje večje količine mutant stiholizina I in stiholizina II. Temu bodo sledili eksperimenti, ki bodo vodili k boljšemu razumevanju posameznih korakov tvorbe por, predvsem pri razločevanju procesa vezave proteina na membrano med procesom vstavitve vijačnice in oligomerizacije. Vsi štirje mutanti vključujejo cistein, ki v nativnih proteinih ni prisoten, kar jim omogoča tvorbo disulfidnih vezi med N–končnim delom proteina in njegovim jedrom. Nastanek takšne vezi bi lahko preprečil njihovo zmožnost ločitve N–konca oz. α–proteinske vijačnice od preostalega proteina in nadaljnje vključitve v membrano, ki je ključen korak pri tvorbi por. Takšen postopek so predhodno uporabili pri dvojnem cisteinskem mutantu aktinoporina ekvinatoksina II, ki je bil sicer še vedno sposoben vezave na membrano in oligomerizacije, sposobnost vstavitve vijačnice v membrano in nastanek por pa sta bila drastično zmanjšana. V primeru potrjene hipoteze bi z nadaljnjimi meritvami lahko podrobneje določili vpliv posameznih korakov pri tvorbi por tudi za stiholizin I in stiholizin II ter tako pridobili dodatne informacije glede procesa nastanka por. V drugem sklopu smo preučevali lastnosti porotvornega proteina stiholizina II z mutacijo D76S (StnII D76S) in jih primerjali z lastnostmi nativnih proteinov stiholizina I in II. Pri vrednotenju lastnosti izoliranega proteina smo uporabili različne spektroskopske tehnike, ki so jih predhodno uporabili na nativnem proteinu in ostalih porotvornih proteinih. Za preučevanje termostabilnosti smo uporabili cirkularni dikroizem, s katerim smo potrdili splošno ohranjenost sekundarne in terciarne strukture StnII D76S. Z izvedbo fluorescenčnega emisijskega spektra smo predvideli delokalizacijo vsaj enega Trp aminokislinskega ostanka, najverjetneje Trp110. Skupina aromatskih aminokislinskih ostankov pri stiholizinu II vključuje Trp110, ki ima pomembno vlogo pri vezavi proteina na membrano, prav tako pa pri prepoznavanju vezavnega mesta, kar je predvsem posledica hidrofobnega učinka. Pri preučevanju interakcij proteina z membrano je mutant izkazal povsem enako hemolizno aktivnost kot stiholizin II. Membrana eritrocita je bolj zapletena od lipidnih veziklov, uporabljenih pri meritvi sproščenega kalceina in izotermalni titracijski kalorimetriji. To otežuje nadzor posameznih komponent pri eksperimentih z eritrociti, zato se pri interpretaciji rezultatov aktivnosti preferenčno osredotočajo na rezultate, pridobljene na lipidnih sistemih. Pri uporabi enostavnejših lipidnih dvoslojev, kot so vezikli fosfolipida (1,2‐dioleoil‐sn‐glicero‐3‐fosfoholina) in sfingomielina v prisotnosti oz. odsotnosti holesterola, so bili rezultati afinitete vezave StnII D76S na membrano višji v primerjavi s stiholizinom II. Prisotnost holesterola v veziklih je razliko med merjenima proteinoma pomembno povišala, kar kaže na sterolov vpliv na vezavno afiniteto stiholizina II. Meritve sproščenega kalceina so nam omogočile meritev nadaljnjih korakov tvorbe por, kot so: difuzija, oligomerizacija in vstavitev v hidrofobno jedro membrane. Mutant StnII D76S je povzročil večjo sprostitev kalceina, čeprav ugotovljene razlike niso bile tako drastične kot pri izotermalni titracijski kalorimetriji. Hipoteza, ki smo jo postavili na začetku, predvideva, da mutacija, izvedena na mestu 76, okrepi vpliv holesterola na lastnosti stiholizina II. Funkcijski eksperimenti so presenetljivo prikazali, da mutacija ni imela vpliva na hemolizo kljub mnogo večji afiniteti za uporabljene lipidne vezikle in povečani sprostitvi kalceina. Čeprav smo našo delovno hipotezo ovrgli, lahko z gotovostjo zaključimo, da ima aminokislinski ostanek stiholizina II na mestu 76 ključno vlogo pri vezavi aktinoporina na membrano. Za podrobnejšo razlago učinka te mutacije na porotvorno sposobnost proteina pa bodo potrebni še dodatni, podrobnejši eksperimenti.

• Language: Slovenian
• Keywords: stiholizini, mutant, vrednotenje lastnosti, interakcija protein–lipid
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2021
• PID: 20.500.12556/RUL-127514
• Publication date in RUL: 11.06.2021

Secondary language

• Language: English
• Title: Preparation and characterization of pore-forming protein sticholysin I and II mutants

Abstract

Sticholysins belong to the family of pore–forming proteins. They can exist either as soluble monomeric proteins or form an oligomeric transmembrane pore, which makes them an optimal model for studying their undergoing change, i.e. from being monomeric and water–soluble proteins to becoming oligomeric transmembrane assemblies. Detailed study has provided a better understanding of separate steps of pore formation mechanism and of the role of specific protein residues. However, further research is needed in order to be able to use these proteins as potential biotechnological and therapeutic tools. Our work was divided into two parts. In the first part, the cysteine mutants of the proteins sticholysin I (I7C, K68C) and sticholysin II (I6C, K67C) were prepared. A standard procedure was followed and the four plasmids with the desired sequence were formed. As all the mutants contain cysteine, not present in the native proteins, they can form disulfide bridges, which could theoretically influence the ability of protein helix stretch insertion into the membrane and prevent it. This would enable to study proteins’ binding to the membrane separately from oligomerization and membrane insertion step. To confirm the hypothesis, further experiments are needed. In the second part, we performed a series of experiments using different mutant: sticholysin II D76S with the aim of comparing its properties with the wild type proteins sticholysin I and sticholysin II. The isolated protein was functionally and spectroscopically characterized using standard methods. The initial hypothesis was that the mutated residue would be responsible for the larger influence of cholesterol on sticholysin II behavior. Surprisingly, the functional experiments revealed that hemolysis remained unaltered, in spite of a much higher affinity for the lipid vesicles assayed. Consequently, greater affinity caused improved leakage. The initial hypothesis was rejected and we concluded that the residue in the sticholysin II 76 position plays a key role in binding of actinoporins to the membrane, probably by dislocating Trp110 residue. Explanation of this behavior in greater detail will require some additional experiments.

• Keywords: sticholysins, mutants, characterization, protein–lipid interaction