Vpliv devterirane vode na vezavne in funkcionalne lastnosti astrocitnega histaminskega receptorja H [spodaj] 2 : [diplomska naloga]

Zorc, Anže (author), Kržan, Mojca (mentor), Mavri, Janez (co-mentor)

Histamin je pomemben endogeni mediator, prisoten v večini človeških tkiv in organov. V osrednjem živčevju ima vlogo živčnega prenašalca, medtem ko v ostalih delih telesa deluje kot lokalni hormon. Svoje učinke posreduje preko 4 podtipov histaminskih receptorjev: H1, H2, H3 in H4. Vsi spadajo v veliko skupino metabotrobnih receptorjev, ki za svoje delovanje in prenos informacije potrebujejo sklopitev z membranskim proteinom G (GPCRs). Histaminski receptor H2 ima poznano primarno strukturo in vsebuje 7 hidrofobnih transmembranskih področij. Primarno vezavno mesto za histamin se nahaja v žepu znotraj lipidnega dvosloja in vključuje aminokislinske ostanke iz področij 3 in 5. Ključno vlogo pri vezavi naj bi imela ionska vez med Asp98 tretjega transmembranskega področja in dušikovim atomom stranske verige histamina, ter vodikove vezi Asp186 in Thr190 petega transmembranskega področja z dušikovimi atomi imidazolnega obroča histamina.V naši raziskavi smo se osredotočili na vpliv vodikovih vezi na vezavne in funkcionalne lastnosti histaminskega receptorja H2. Z zamenjavo kontrolnega okolja (H2O) z devteriranim okoljem (D2O), zaradi nuklearnih kvantnih efektov povzročimo spremembe medmolekulskih in znotrajmolekulskih razdalj, saj se izmenljivi atomi vodika, tj. taki, ki disociirajo, zamenjajo z dvakrat težjimi atomi devterija. To vodi do strukturnih sprememb ligandov in vezavnega mesta na receptorju, ki se odrazijo v spremenjenih vezavnih in funkcionalnih lastnostih receptorja. V diplomskem delu smo opredelili vezavna receptorska mesta na histaminskem receptorju H2 na astrocitih neonatalnih podgan, vzgojenih v primarni kulturi, pokazali ključno vlogo vodikove vezi pri interakciji ligandov na ta podtip receptorja in preverili, kako se strukturne spremembe ligandov in receptorja odrazijo v vezavnih (maksimalna gostota vezavnih mest, afinteta vezave) in funkcionalnih (s histaminom izzvana produkcija cAMP) lastnostih receptorja. Uporabili smo metode vezavnih študij, kjer smo z uporabo radioliganda 3H-tiotidina dokazali prisotnost histaminskih receptorjev H2 na astrocitih neonatalnih podgan, vzgojenih v primarni kulturi, z maksimalno gostoto vezavnih mest 21,95  3,2 fmol/mg proteinov in ravnotežno disociacijsko konstanto 6,3  1,9 nM. V devteriranem okolju je maksimalna gostota vezavnih mest za 3H-tiotidin znašala 17,42  5,2 fmol/mg proteina, ravnotežna disociacijska konstanta pa 8,63 ± 5,0 nM, vendar razliki nista statistično značilni. V inhibicijski študiji smo potrdili, da se afiniteta cimetidina (antagonista) do vezavnih mest histaminskega receptorja H2 ni bistveno spremenila. V kontrolnem okolju s H2O je pIC50 znašala 7,7 ± 0,49, medtem ko je v devteriranem okolju znašala 7,6 ± 0,21. V funkcijski študiji smo z merjenjem koncentracije znotrajceličnega cAMP potrdili zmanjšanje s histaminom izzvane produkcije cAMP v devteriranem okolju. Ugotovili smo tudi, da je za padec v produkciji cAMP v devteriranem okolju v pretežni meri odgovorna zmanjšana afiniteta agonista (histamina) do vezavnega mesta na histaminskem receptorju H2, saj se afiniteta antagonista do vezavnega mesta (cimetidina) ni bistveno spremenila. Sklenemo lahko, da vodikova vez igra pomembno vlogo pri vezavi ligandov na histaminski receptor H2 na astrocitih neonatalnih podgan. Devterirano okolje vpliva na vezavo ligandov na histaminski receptor H2, saj povzroči spremembo razdalj in jakosti vodikovih vezi, te spremembe pa so bolj izrazite pri vezavi agonistov, kot pri vezavi antagonistov. Spremenjene vezavne lastnosti histamina se odrazijo v padcu s histaminom izzvane produkcije cAMP.

• Language: Slovenian
• Keywords: histamin histaminski receptor H2 vodikova vez devterirana voda cAMP
• Work type: Undergraduate thesis
• Typology: 2.11 - Undergraduate Thesis
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Place of publishing: Ljubljana
• Publisher: [A. Zorc]
• Year: 2013
• Number of pages: XI, 58 f.
• PID: 20.500.12556/RUL-121139
• UDC: 544.1
• COBISS.SI-ID: 5206554
• Publication date in RUL: 30.09.2020

Secondary language

• Language: English
• Title: The influence of deuterium oxide on binding and functional characteristics of histamine H [sub] 2 receptor in astrocytes

Abstract

Histamine is an important endogenous mediator present in most human tissues and organs. In central nervous system it acts as a neurotransmitter while in other parts of the body plays a role of a local hormone. Histamine exerts its actions by combining with 4 type of specific cellular histamine receptors: H1, H2, H3 in H4, which are all G protein-coupled receptors (GPCRs). Histamine H2 receptor consists of seven transmembrane domains. Aminoacid residues on the third and fifth transmembrane domains play a crucial role in binding of histamine to this receptor subtype. Ionic bond between Asp98 on the third TM domain and nitrogen atom on the alyphatic amino group and hydrogen bonds of Asp186 and Thr190 with nitrogen atoms of the imidazole ring are believed to be essential in binding of histamine. If hydrogen atoms are replaced with deuterium ones the intermolecular and intramolecular distances would change, thus leading to structural changes of binding sites on receptor and ligands resulting in modification of binding and functional parameters of histamine H2 receptor. In our study we defined binding sites on histamine H2 receptor subtype on cortical astrocytes in a primary culture, demonstrated the importance of the hydrogen bond in ligand-receptor interactions (maximal binding capacity, affinity of ligand binding) and functional activity (histamine dependant production of cAMP) of histamine H2 receptor. Using 3H-tiotidine as a radioligand we determined the presence of histamine H2 receptor subtype on newborn rat cortical astrocytes in primary culture, with maximal binding capacity (Bmax) at 21,95 ± 3,2 fmol/mg protein and dissociation constant 6,3 ± 1,9 nM. In the deuterium milieu maximal binding capacity was 17,42  5,2 fmol/mg protein and dissociation constant was 8,63 ± 5,0 nM but the differences were not statistically significant. In our displacement study we determined that affinitiy of binding to histamine H2 receptor for cimetidin in deuterium milieu practically stayed the same in regards to control environment. In our control milieu (H2O) pIC50 was 7,7 ± 0,49, meanwhile in deuterium oxide the pIC50 was 7,6 ± 0,21. In our study of functional activity of histmine H2 receptor we determined that deuterium milieu has caused decrease in histmain dependant production of intracellular cAMP. This is mainly the result of decreased affinity of binding to histamine H2 receptor for histamine. We can conclude that hydrogen bond is crucial for the binding of histamine to histamine H2 receptor on newborn rat cortical astrocytes in a primary culture. The addition of deuterium oxide changes the distance and the strength of hydrogen bonds which affects the binding characteristics of histamine H2 receptor and therefore has an influence on the binding of agonists to histamine H2 receptor. Changed binding characteristics translate to decrease in histamine dependant production of cAMP.

• Keywords: histamine histamine H2 receptor subtype hydrogen bond deuterium oxide cAMP