Izdelava in vrednotenje nanodostavnega sistema s kurkuminom za inhaliranje

Zupančič, Špela (author), Kocbek, Petra (mentor), Somavarapu, Satyanarayana (co-mentor)

Številne raziskave so potrdile antioksidativno, protitumorno in protivnetno delovanje kurkumina; poleg tega so v raziskavah dokazali, da je njegova uporaba varna tako pri ljudeh kot tudi pri živalih. Klinične študije pa so pokazale le majhno učinkovitost po peroralnem vnosu, saj je biološka uporabnost kurkumina majhna, kar je posledica slabe vodotopnosti, majhne absorpcije, hitrega metabolizma in eliminacije iz telesa. Tako ostaja velik izziv razvoj novih formulacij in farmacevtskih oblik, ki bodo povečale učinkovitost zdravljenja s kurkuminom. Cilj tega magistrskega dela je bil razvoj in vrednotenje farmacevtske oblike za inhaliranje s kurkuminom vgrajenim v nanodostavni sistem. Na ta način smo skušali povečati topnost kurkumina v vodnem mediju z vgrajevanjem v nanodostavni sistem iz dekalinija - DQAsome, ovrednotiti lastnosti DQAsomov, stabilnost kurkumina v DQAsomih pri različnih pH-jih, antioksidativne lastnosti kurkumina v nanodostavnem sistemu in z uporabo in vitro modela dihalnega trakta preveriti lastnosti aerosola formulacije z DQAsomi, v zadnjem delu pa ugotavljali, ali z DQAsomi lahko dosežemo ciljano dostavo kurkumina v mitohondrije. Za pripravo DQAsomov s kurkuminom smo uporabili dve metodi: metodo tankega filma in dializno metodo. DQAsome smo izdelali z različnimi molarnimi razmerji med kurkuminom in dekalinijem (molarno razmerje dekalinij : kurkumin 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2 in 1 : 3). Pogoje izdelave smo spreminjali (temperatura rehidriranja tankega filma, čas soniciranja, uporaba centrifugiranja) s ciljem, da bi dosegli čim večjo vsebnost in učinkovitost vgrajevanja kurkumina v nanosistem. DQAsome smo fizikalno ovrednotili (povprečna velikost, zeta potencial) in s HPLC analizo ugotavljali učinkovitost vgrajevanja in vsebnost kurkumina. Morfološke značilnosti DQAsomov smo določili s pomočjo presevne elektronske mikroskopije. Disperzijo DQAsomov s kurkuminom smo liofilizirali brez in s krioprotektantom, da bi tako pripravili dolgoročno stabilno obliko s kurkuminom. Lastnosti liofilizata smo ovrednotili tako, da smo ga redispergirali v vodi pod različnimi pogoji. Liofilizirane formulacije brez krioprotektanta smo analizirali z X-žarkovno difrakcijo in diferenčno dinamično kalorimetrijo z namenom, da bi ugotovili, v kakšni kristalni obliki je vgrajen kurkumin. Z infrardečo spektroskopijo s Fourierjevo transformacijo pa smo ugotavljali interakcije med obema komponentama DQAsomov tj. med dekalinijem in kurkuminom. Stabilnost DQAsomov smo preverjali v vodnih medijih z različnimi pH-ji. Spremembo povprečne velikosti, naboja in učinkovitost vgrajevanja smo določili po 40 dneh od priprave DQAsomov. Formulacije DQAsomov smo ovrednotili z antioksidativnim testom takoj po izdelavi in po 60 dneh ter rezultate primerjali z antioksidativno aktivnostjo samega kurkumina in kvercetina kot standarda. Velikost kapljic aerosola je ključnega pomena za uspešno dostavo učinkovine v pljuča, zato smo s farmakopejsko metodo preverjali lastnosti aerosola nebulirane formulacije DQAsomov. Vstop DQAsomov s kurkuminom in ciljanje mitohondrijev smo ugotavljali in vitro na celični liniji Caco-2 s pomočjo specifičnega fluorescenčnega barvanja in konfokalne mikroskopije. Metoda tankega filma se je izkazala kot zelo uspešna v primerjavi z dializno metodo, kjer DQAsomi s kurkuminom niso nastali. Priprava delcev pri 80 °C in daljšim časom soniciranja je bila bolj učinkovita kot izdelava DQAsomov pri 25 °C, kar se je izkazalo kot manjša povprečna velikost delcev (npr. ~160 nm v primerjavi s ~175 nm) in večja vsebnost (npr. 9 % v primerjavi s 23 %) in učinkovitost vgrajevanja (npr. 36 % v primerjavi s 87 %) kurkumina (zapisane vrednosti so primerjava za DQAsome z molarnim razmerjem dekalinij : kurkumin 2 : 1). Velikost DQAsomov, ki smo jih pripravili pri 80 °C, je bila med 160 in 205 nm in zeta potencial ~50 mV. Velikost DQAsomov je naraščala z vsebnostjo kurkumina v nanosistemu, učinkovitost vgrajevanja pa je bila neodvisna (~90 %) od molarnega razmerja med dekalinijem in kurkuminom, ki smo ga uporabili za izdelavo. Kurkumin je bil vgrajen v DQAsome z vsebnostjo do 61 %. Ugotovili smo, da se je zgradba DQAsomov pri liofilizaciji delno porušila, saj liofilizatov ne glede na prisotnost krioprotektanta nismo mogli uspešno redispergirati. Le 10 % formulacije DQAsomov (vrednoteno glede na kurkumin) z molarnim razmerjem dekalinij : kurkumin 2 : 1 in z dodano 5 % laktozo monohidratom kot krioprotektantom smo uspešno redispergirali v vodi. Tako difraktogrami X-žarkovne difrakcije brez ostrih vrhov pri liofiliziranem vzorcu DQAsomov kot tudi prisotnost steklastega prehoda na krivulji istega vzorca pridobljene z diferenčno dinamično kalorimetrijo sta potrdili amorfno stanje obeh sestavin v vzorcu, kar je lahko posledica vgrajevanja kurkumina v strukturo DQAsomov ali same liofilizacije. Pri spektrih pridobljeni z infrardečo spektroskopijo s Fourierjevo transformacijo so bili vidni premiki vrhov, zmanjšana ločljivost in intenziteta določenih vrhov, nekateri vrhovi so pri liofiliziranih vzorcih DQAsomov celo izginili v primerjavi s spektri samega kurkumina, dekalinija in njune fizikalne mešanice. Spremembe, ki smo jih opazili smo pripisali vodikovim vezem in hidrofobnim interakcijam, ki se pojavijo med kurkuminom in dekalinijem v DQAsomih. Oblika DQAsomov s kurkuminom je bila nepravilno okrogla z na videz močno nagubano površino, medtem ko je bila oblika praznih DQAsomov pravilno okrogla. Tudi morfologija vzorca DQAsomov s kurkuminom po 40 dneh je bila nespremenjena. Velikost delcev na slikah pridobljenimi s presevnim elektronskim mikroskopom se je ujemala z velikostjo DQAsomov v disperziji, ki smo jo izmerili z metodo dinamičnega sipanja laserske svetlobe tj. 160,7 ± 2,9 nm. DQAsomi s kurkuminom, ki smo jih izdelali iz dekalinija in kurkumina v molarnem razmerju 2 : 1, so izkazali fizikalno stabilnost v vodi in vodnem mediju s pH 1,2 tekom 40 h, medtem ko smo pri vzorcu samega kurkumina opazili nestabilnost tj. obarjanje kurkumina. Rezultat dokazuje, da smo z vgrajevanjem kurkumina v nanodostavni sistem z dekalinijem uspeli povečati njegovo topnost v vodnem mediju. DQAsomi s kurkuminom, ki smo jih izdelali iz dekalinija in kurkumina v molarnem razmerju 1 : 2, so bili manj stabilni, saj smo pri pH 1,2 opazili obarjanje, medtem ko je bila formulacija v vodi stabilna. Pri pH 13 je sam kurkumin podvržen hitremu razpadu, medtem ko v DQAsomih kationi dekalinija delno stabilizirajo negativno nabito deprotonirano obliko kurkumina (za ~30 % v primerjavi s prostim kurkuminom v vodi). Stabilizacijski učinek dekalinija je bil manjši v primeru DQAsomov z večjo količino vgrajenega kurkumina. Velikost in zeta potencial DQAsomov v disperziji se pri sobnih pogojih v časovnem obdobju 40 dni nista signifikantno spremenila, medtem ko sta se vsebnost in učinkovitost vgrajevanja zmanjšala za najmanj 20 %. Večja kot je bila vsebnost kurkumina, bolj so bili DQAsomi nestabilni in bolj se je s staranjem zmanjšala učinkovitost vgrajevanja. Antioksidativna aktivnost DQAsomov s kurkuminom takoj po izdelavi in po 60 dneh je bila nespremenjena. Tako lahko sklepamo, da sam postopek priprave kot tudi staranje vzorca ne vplivata na antioksidativno aktivnost kurkumina v DQAsomih. Z vgrajevanjem kurkumina v nanodostavni sistem pa se je antioksidativna aktivnost kurkumina v primerjavi s samim kurkuminom v vodi izboljšala. DQAsome, ki smo jih izdelali iz dekalinija in kurkumina v molarnem razmerju dekalinj : kurkumin 2 : 1, so izkazovali najboljšo fizikalno stabilnost med izdelanimi formulacijami, zato smo jih izbrali za vrednotenje lastnosti aerosola po nebuliranju. Disperzijo DQAsomov smo nebulirali z nebulatorjem na zračni tok in vrednotili dostavo v različna področja aparature, ki smo jo uporabili kot in vitro model dihalnega trakta. Tako smo proučevali odlaganje nebulirane formulacije v grlu, zgornjem in spodnjem delu dihalnih poti. Kar 85 % dovedenega odmerka kurkumina je doseglo spodnji del aparature, ki predstavlja spodnje dihalne poti. Rezultat kaže zelo dobre inhalacijske lastnosti formulacije DQAsomov. In vito poskusi na celični liniji Caco-2 so potrdili vstop kurkumina v celice. S fluorescenčnim barvanjem celičnih organelov (mitohondrijev in jeder) smo s pomočjo kolokalizacije fluorescence ugotovili, da se je kurkumin po vstopu v celice lokaliziral v glavnini v mitohondrijih. Z izdelavo nanodostavnega sistema na osnovi dekalinija smo uspeli povečati vodotopnost kurkumina iz 22 ng/ml na 9,3 x 106 ng/ml. Tudi učinkovitost vgrajevanja v DQAsome je bila zelo velika (~90 %). Kljub vsemu pa se je izkazalo, da je večja vsebnost kurkumina v DQAsomih povzročila nestabilnost njihove strukture v vodi, vodnem mediju s pH 1,2 in 13 ter vodi in raztopini soli. Delci z najnižjim molarnim razmerjem dekalinij : kurkumin (2 : 1) pa so izkazali stabilnost pri vodnem mediju s pH 1,2 in v vodi ter za tretjino zmanjšali kemijski razpad kurkumina pri pH 13. Antioksidativna aktivnost kurkumina se je po vgrajevanju v DQAsome ohranila. Aerosol nebulirane formulacije DQAsomov s kurkuminom je izkazoval ustrezne lastnosti za učinkovito dostavo kurkumina v pljuča. S poskusom na celicah smo dokazali učinkovito dostavo in ciljanje mitohondrijev z DQAsomi. Na podlagi rezultatov lahko zaključimo, da DQAsomi s kurkuminom predstavljajo novo formulacijo, ki kaže obetavne lastnosti za učinkovito dostavo kurkumina v pljuča in omogoča ciljano dostavo na subceličnem nivoju tj. ciljanje mitohondrijev.

• Language: English
• Keywords: curcumin nanodelivery systems DQAsomes pulmonary drug delivery mitochondrial targeting
• Work type: Master's thesis/paper
• Typology: 2.09 - Master's Thesis
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Place of publishing: Ljubljana
• Publisher: [Š. Zupančič]
• Year: 2013
• Number of pages: XI, 64 f.
• PID: 20.500.12556/RUL-121099
• UDC: 54:620.2(043.3)
• COBISS.SI-ID: 3516529
• Publication date in RUL: 30.09.2020

Secondary language

• Language: Slovenian
• Title: Formulation and characterization of curcumin loaded nanodelivery system for inhalation

Abstract

Curcumin has potent antioxidant and anti-inflammatory activities, but low bioavailability due to poor aqueous solubility, low oral absorption, and rapid metabolism. Our study aimed to improve the solubility and stability of curcumin by incorporating it in a nanodelivery system. We also aimed to enhance curcumin bioavailability by formulating it for pulmonary delivery, and to further improve its antioxidant properties by targeted delivery to cell mitochondria. Thin-film and dialysis methods were used for preparation of curcumin loaded DQAsomes (vesicles based on dequalinium), which were characterized physicochemically. Among these, only thin film method enabled formulation of curcumin loaded DQAsomes. Curcumin was incorporated in DQAsomes with high drug loading (up to 61%) and high entrapment efficiency (~90%). The average size of DQAsomes was 160–200 nm, with zeta potential of ~50 mV and irregular spherical morphology, with wrinkles visible on particle surface. Only 10% of freeze-dried formulation was successfully redispersed. Curcumin in DQAsomes was in amorphous state, as confirmed by differential scanning calorimetry and X-ray powder diffraction. Fourier-transform infrared spectroscopy study confirmed presence of hydrogen bonds and hydrophobic interactions between dequalinium and curcumin in DQAsomes. Curcumin in DQAsomes with a molar ratio of 1:2 (dequalninium:curcumin) was stable at pH 1.2, and the extent of curcumin alkaline hydrolysis at pH 13 was reduced. Average size and zeta potential of DQAsomes remained unchanged over 40 days, but drug loading decreased by minimum of 20%. Nebulization using a jet nebulizer resulted in more than 85% of curcumin being deposited in the lower stage of two-stage impinger (used as an in vitro model of respiratory tract) indicating good aerosol properties for alveolar drug delivery. Formulation of curcumin in DQAsomes enhanced its antioxidant activity, which remained unaltered over 60 days. Preliminary studies in human epithelial cell line Caco-2 confirmed mitochondrial targeting properties of our curcumin DQAsomes. The high loading efficiency, enhanced solubility and stability, successful nebulization, retention of antioxidant activity and potential for mitochondrial targeting demonstrate curcumin loaded DQAsomes as a novel and promising therapeutic approach for pulmonary delivery of curcumin.

• Keywords: kurkumin nanodostavni sistemi DQAsomi dostava učinkovin v pljuča ciljanje mitohondrijev stabilnost kurkumina