Nevtrofilci so najštevilčnejše in najpomembnejše celice prirojenega imunskega sistema. Njihov odziv je takojšen, nespecifičen in v primerjavi s celicami pridobljenega imunskega sistema ne zagotavljajo dolgotrajne imunske zaščitite proti mikroorganizmom. Tako so prva linija obrambe pred okužbami in posledično lahko nevtralizirajo patogene preden se ti razmnožijo in povzročijo večjo škodo. Le te uničijo s pomočjo fagocitoze, protimikrobnih encimov in zunajceličnimi pastmi nevtrofilcev.
Zunajcelične pasti nevtrofilcev so kompleksna tvorba oz. preplet zunajceličnih vlaken, ki so sestavljena iz DNA in toksičnih granul in se vežejo na zunajcelične patogene ter jih posledično ubijejo. Zmožne so uloviti velik nabor mikroorganizmov in jih predstaviti protimikrobnim granulam ter drugim celicam, da jih le te fagocitirajo. Sprostitev DNA pasti nastopi po aktivaciji nevtrofilcev oz. ob prisotnosti patogenov v zunajceličnem prostoru nevtrofilcev in traja manj kot eno sekundo, kar omogoča hitro eliminacijo tujkov. Zanimivo je tudi, da so podobne zunajcelične DNA strukture opisane pri rastlinah, kjer branijo korenine pred okužbami. Omenjena opazovanja podpirajo dejstvo, da DNA poleg svoje funkcije shranjevanja in zagotavljanja genetskih informacij igra dodatno vlogo pri prirojenem imunskem sistemu, ki je ohranjena vse od rastlin, prek žuželk, različnih vretenčarjev do človeka.
Za uspešen nastanek zunajceličnih pasti nevtrofilcev morajo nevtrofilci biti optimalno zreli. Njihov mehanizem nastanka je zelo kompleksen in do danes še ni v celoti definiran. Kljub temu smo od njihovega prvega odkritja v letu 2004 do sedaj na podlagi raziskav H.U. Simon in S. Yousefi pridobili mnogo novih spoznanj o njihovih lastnostih in nastanku. Tako vemo, da je uspešno tvorjenje zunajceličnih pasti nevtrofilcev odvisno od nastanka reaktivnih kisikovih zvrsti. Inhibitorji NADPH – oksidaze, ki blokirajo nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti, posledično uspešno zavrejo nastanek zunajceličnih pasti. Nevtrofilci pacientov z dedno kronično granulomatozno boleznijo imajo pomanjkanje encima NADPH – oksidaze, zmanjšano tvorbo reaktivnih kisikov zvrsti in zunajceličnih pasti. Kot posledica se pri takih pacientih pojavljajo ponavljajoče glivične in bakterijske okužbe. Poleg reaktivnih kisikovih zvrsti je za nastanek pasti bistvenega pomena tudi polimerizacija aktina. Lantrukulin B prepreči vezavo monomernega G-aktina na ATP in na ta način moti polimerizacijo aktina ter izgradnjo citoskeleta. Lantrukulin B uspešno prepreči nastanek zunajceličnih pasti nevtrofilcev, hkrati pa ne vpliva na nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti. Enega izmed pomembnih gradnikov citoskeleta predstavljajo tudi mikrotubuli, ki pomagajo pri stabilizaciji strukture celice in nadzorujejo pretok granul v celici. Nokodazol in paklitaksel sta zaviralca izgradnje mikrotubulne mreže in uspešno zavirata nastanek zunajceličnih pasti brez vpliva na polimerizacijo aktina ali nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti. Protein optične atrofije 1 (OPA1) je ključni element v dinamiki in morfologiji mitohondrijev. Pomemben je za mitohondrijsko fuzijo in strukturno integriteto. Pacienti z avtosomalno dominantno optično atrofijo ne tvorijo zunajceličnih pasti nevtrofilcev. Defekt v OPA1 zmanjša aktivnost mitohondrijskega kompleksa I in zmanjša koncentracijo NAD+, ki je potreben za nemoten potek glikolize. Posledično imajo taki nevtrofilci manjšo koncentracijo znotrajceličnega ATP-ja, ne morejo tvoriti mikrotubulnih mrež in tako zunajceličnih pasti.
V nalogi sem se v veliki meri posvetil raziskovanju vloge proteinov BAX in BAK pri nastanku zunajceličnih pasti nevtrofilcev. To sta proapoptotična proteina, ki tvorita oligomere na zunanji membrani mitohondrijev in omogočata pretok snovi med mitohondriji in citosolom, kar posledično sproži aktivacijo različnih kaspaz in končno privede do tipične apoptotične celične smrti. Omenjena proteina sta tudi nujna za izločanje mitohondrijske DNA v citosol. Zaradi dejstva, da je DNA za nastanek zunajceličnih pasti nevtrofilcev mitohondrijskega izvora, nas je zanimalo, ali imata proteina morda kakršno vlogo pri nastanku teh pasti. Kot naslednje smo se osredotočili na vlogo napetostno odvisnih anionskih kanalov (VDAC) pri nastanku zunajceličnih pasti nevtrofilcev. To so najpogostejši proteini na zunanji mitohondrijski membrani in pomembni za izmenjavo različnih molekul in ionov med intermembranskim prostorom in citosolom. Najpomembnejši predstavnik je napetostno odvisni anionski kanal 1 (VDAC1). Nazadnje smo še pogledali citoplazemski protein Gasdermin D, ki ima pomembno vlogo pri piroptozi, ki je vrsta programirane celične smrti. Po aktivaciji gasdermina D pride do nastanka por na celični membrani in nato do piroptoze.
Primarni cilj naloge je bil raziskati vpliv proteinov BAX, BAK, VDAC1 in gasdermin D pri nastanku zunajceličnih pasti nevtrofilcev. Za oceno nastanka zunajceličnih DNA mrež smo uporabili dve metodi, eno kvantitativno, drugo kvalitativno. S pomočjo spektrofluorimetra in kompleta Quant-iTTM PicoGreen Assay Kit smo kvantificirali sproščeno dvojno vijačno DNA (dsDNA) v celičnih supernatantih. Kvalificirali smo jo z metodo skeniranja s konfokalnim laserskim mikroskopom, kjer smo nevtrofilce aktivirali in nato fiksirali s 4 % paraformaldehidom na krovna stekelca ter obarvali z barvili MitoSox in Hoechst. S pomočjo dihidrorodamina 123 smo nadzirali tudi proizvodnjo reaktivnih kisikovih zvrsti, da se potrdi funkcionalnost proksimalnih poti v uporabljenih celicah. Kot dodatek k rezultatom smo analizirali stopnjo diferenciacije posamezne celične linije in ekspresijo proteinov BAX in BAK v uporabljenih celicah.
Za naše eksperimente smo izbrali celično linijo mišjih Hoxb8 nevtrofilcev in sveže izolirane humane nevtrofilce, ki so bili že uporabljeni v okviru različnih študij in eksperimentov pri preiskovanju nastanka zunajceličnih pasti nevtrofilcev. Prednosti mišjih Hoxb8 nevtrofilcev pred humanimi nevtrofilci so neomejena generacija celic, enostavna genetska manipulacija in analiza diferenciranih celic in vitro. Tako sta se obe vrsti celic izkazali kot dober sistem za oceno nastanka zunajceličnih pasti, induciranih s pomočjo različnih aktivatorjev.
Za študijo nastanka zunajceličnih pasti nevtrofilcev smo Hoxb8 nevtrofilce in izolirane humane nevtrofilce najprej stimulirali z granulocitne – makrofagne kolonije spodbujajočim faktorjem (GM-CSF) in nato s komponento komplementa 5a (C5a) ali lipopolisaharidom (LPS). Za pozitivno kontrolo smo nevtrofilce stimulirali s forbol 12-miristat 13-acetatom (PMA). Pri eksperimentih s humani nevtrofilci smo te 30 minut pred stimulacijo inhibirali z naslednjima inhibitorjema: nekrosulfonamid (5 μM) in VBIT–4 (5 μM). Nekrosulfonamid se veže na gasdermin D kar prepreči nastanek por na celični membrani. VBIT–4 je inhibitor oligomerizacije proteina VDAC1.
Rezultati kvantifikacije in kvalifikacije zunajceličnih pasti nevtrofilcev s Hoxb8 nevtrofilci so nam pokazali, da oba proteina tako BAX kot BAK igrata vlogo pri izločanju pasti. Obseg izločanja pasti je bil pri nevtrofilcih z enojno izbitim Bax ali Bak in pri dvojno izbitih signifikantno manjši v primerjavi z divjim tipom nevtrofilcev. V nasprotju pomanjkanje proteina gasdermin D v Hoxb8 nevtrofilcih ni bistveno vplivalo na nastanek zunajceličnih pasti v primerjavi z divjim tipom nevtrofilcev. Kot pričakovano, smo dobili podobne rezultate s humanimi nevtrofilci in uporabo nekrosulfonamida, inhibitorja gasdermina D, kjer ni bilo signifikantnega zmanjšanja sproščene dvojno vijačne DNA v primerjavi z neobdelanimi nevtrofilci. Pri uporabi VBIT-4, inhibitorja VDAC1 oligomerizacije, smo prav tako ugotovili, da inhibitor ni bistveno vplival na sproščanje dvojno vijačne DNA. V vseh primerih so se rezultati kvantifikacije ujemali s slikami, pridobljenimi s skeniranjem s konfokalnim laserskim mikroskopom. Po stimulaciji so vse celice ostale ustreznih oblik kljub formiranju zunajceličnih mrež. Jedra smo obarvali z barvilom Hoechst, sproščene mreže DNA pa z barvilom MitoSox, kar nakazuje, da je DNA formiranih mrež mitohondrijskega izvora in da nevtrofilci pri sami stimulaciji ne podležejo apoptozi. Delež živih nevtrofilcev smo določili s pomočjo propidijevega jodida. To barvilo prehaja le čez membrane mrtvih celic, kjer se veže na DNA.
|
