Kemokini in glikozaminoglikani igrajo pomembno vlogo v vnetju in migraciji levkocitov iz krvi skozi endotelijsko plast proti mestu vnetja. Kemokini ali kemotaktični citokini so majhni signalni proteini, z molekulsko maso 6-14 kDa in dolžine 70-125 aminokislinskih ostankov. Vežejo se na z G-proteinom sklopljen receptor s sedmimi transmembranskimi domenami. Vezava kemokina povzroči aktivacijo kaskadnih reakcij, ki na koncu vodijo do aktivacije protein kinaze C in celičnega odziva. Do danes je znanih več kot 50 kemokinov in 18 njihovih receptorjev. Različni kemokini se lahko vežejo na isti receptor, in obratno, en kemokin se lahko veže na več receptorjev. Ob vnetju tkivni makrofagi sprostijo vnetne mediatorje, med katerimi so tudi kemokini, kar aktivira endotelijsko plast. Endotelijske celice izrazijo adhezijske molekule, kar vodi v upočasnjeno kotaljenje levkocitov vzdolž endotelijske plasti. Sproščeni kemokini se vežejo tudi na glikozaminoglikane, ki so predstavljeni na površini endotelijskih celic in omogočijo vezavo kemokinov na njihov receptor na imunskih celicah. Po vezavi kemokinov na receptor, se na levkocitih aktivira integrin, ki se nato veže s svojim ligandom na endotelijskih celicah. Ta močnejša povezava omogoči prehod levkocitov skozi endotelijsko plast proti vnetju. Največja koncentracija kemokinov je prav v centru vnetja, kar omogoči kemotakso imunskih celic in njihovo delovanje prav na mestu vnetja. Glikozaminoglikani so dolge polisaharidne verige s ponavljajočimi disaharidnimi strukturami. Predstavniki so hialuronska kislina, kronidin sulfat, keratin sulfat, dermatan sulfat, heparin in heparan sulfat. Vsi razen hialuronske kisline so visoko sulfatirani, kar jim da negativen naboj. Med sintezo glikozaminoglikanov pride do velikega števila modifikacij in sicer N-deacetilacij, N-sulfatacij, epimerizacij in O-sulfatacij, kar vodi v veliko število modificiranih verig in njihovo sposobnost vezave različnih molekul. Glikozaminoglikani so kovalentno vezani na glavni (sidrni) protein in skupaj z njim tvorijo proteoglikane. Proteoglikani so razdeljeni v skupine gleda na njihovo lokalizacijo. V študiji smo se osredotočili na proteoglikane na celičnih površinah, s poudarkom na sindekanih in glipikanih. Večina dosedanjih študij je bila usmerjenih v raziskavo vloge glikozaminoglikanov na površini epitelijskih celic, zelo malo pa je znano o njihovi aktivnosti na površini levkocitov. V raziskavi smo blokirali aktivnost glikozaminoglikanov na nevtrofilcih in T-celicah z njihovo razgradnjo s heparinazo C in s kompetitivno inhibicijo z dodatkom nespecifičnega glikozaminoglikan vezočega proteina ter heparan sulfata. Migracijo celic smo nato opazovali z metodo Boydenove komore, kjer smo migracijo tretiranih celic primerjali z migracijo netretiranih. Celice pri tej metodi potujejo proti kemokinskemu gradientu skozi membrano, ki predstavlja endotelijsko plast. Uporabili smo tri različne koncentracije kemokinov. Po migraciji smo celice pritrdili na membrano in obarvali. Celice smo prešteli pod mikroskopom in število delili s specifičnim ozadjem (migracija celic proti pufru in ne kemokinom). Analizirali smo osem membran za vsako vrsto celic. Nadalje smo primerjali še migracijo celic po njihovem različnem spiranju po inkubaciji s heparinazo C. Med seboj smo primerjali netretirane celice in celice po treh načinih spiranja. V prvem so bile celice, pri katerih heparinazo C in majhne fragmente glikozaminoglikanov nismo odstranili. V drugem smo celice pred migracijo centrifugirali in jih suspendirali v svežem pufru, tako da smo odstranili heparinazo C in fragmente glikozaminoglikanov. V tretjem vzorcu smo heparinazo C prav tako odstranili, dodali pa smo še heparan sulfat. Za ugotovitev, kateri proteoglikani so predstavljeni na površini nevtrofilcev, smo analizirali izražanje sidrnih proteinov v relaciji z izražanjem referenčnega gena z metodo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo. Z metodo transendotelijske migracije smo ugotavljali hkratni vpliv glikozaminoglikanov na površini nevtrofilcev in endotelijskih celic, na migracijo nevtrofilcev. Pri tej metodi celice potujejo skozi plast endotelijskih celic namesto skozi membrano. Polovici le-teh smo pred sejanjem na filter odstranili glikozaminoglikane s heparinazo C. Prav tako smo polovico nevtrofilcev inkubirali s heparinazo C, heparan sulfatom ali obema in izvedli analizo z različnima kombinacijama tretiranih celic. Dokazali smo, da odstranitev glikozaminoglikanov s površine nevtrofilcev s heparinazo C zavre migracijo celic proti kemokinu pri vseh tretiranih koncentracijah. Ravno nasprotno je kompetitivno zaviranje z glikozaminoglikan vezočim proteinom povzročilo povečanje migracije nevtrofilcev. Dodatek heparan sulfata ni povzročil sprememb v migraciji celic, razen pri srednji koncentraciji (0.15 μM) kemokina, kjer je bilo opazno rahlo povečanje. Pri limfocitih T je bila migracija povečana samo pri najvišji testirani koncentraciji kemokina v vseh treh vzorcih. Različni koraki spiranja heparinaze C so vodili do majhnih razlik v migraciji, in sicer se je migracija zmanjšala pri vzorcu, kjer heparinaza C in majhni delčki glikozaminoglikanov niso bili odstranjeni iz vzorca v primerjavi s spranimi celicami. Dodatek heparan sulfata ni povzročil sprememb v migraciji. Vsi vzorci celic, tretiranih s heparinazo C, so pokazali zmanjšano migracijo napram netretiranim nevtrofilcem. Limfociti T pri tem poskusu niso pokazali razlik v migraciji. Analiza s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo je pokazala veliko odstopanje v izražanju različnih sindekanov in glipikanov med nevtrofilci. Prevladujejo sindekan-1, sindekan-4, glipikan-2 in glipikan-5. Sindekana-3 in glipikana-6 nismo detektirali na nevtrofilcih. Metoda transendotelijske migracije je potrdila rezultate že zbrane z metodo Boydenove komore. Nevtrofilci, inkubirani s heparinazo C, so migrirali manj skozi netretirane endotelijske celice kot netretirani. Prav tako je bilo opazno zmanjšanje migracije pri vzorcih, ki smo jim dodali heparan sulfat, in vzorcih, kjer smo nevtrofilce najprej inkubirali s heparinazo C in dodali heparan sulfat. V poskusih, kjer smo tudi endotelijske celice tretirali s heparinazo C, se je migracija vseh celic zelo zmanjšala, vključno z netretiranimi nevtrofilci. Presenetljivo se je migracija rahlo povečala pri nevtrofilcih, tretiranih s heparinazo C napram netretiranim. Poskus, v katerem smo nevtrofilce inkubiranli s heparinazo C in dodali heparan sulfat, je pokazal veliko povečanje v migraciji. Dokazali smo da glikozaminoglikani na nevtrofilcih močno vplivajo na njihovo migracijo, saj se je po odstranitvi le-teh migracija zelo zmanjšala. Povečana migracija nevtrofilcev po dodatku glikozaminoglikani- vezočega proteina bi lahko bila odraz razkritja vezavnih mest za kemokine na sladkornih verigah, ki so drugače pokrite s proteini. V naši raziskavi smo uporabili prašičji heparan sulfat. Za nadaljnje študije bi bilo primernejše uporabiti človeškega, da bi dobili zanesljivejše rezultate. Kemotaksa limfocitov T ni pokazala razlik v migraciji tretiranih in netretiranih celic, zato bi bile potrebne spremembe v njihovi stimulaciji. Opažena razlika v migraciji v poskusih z metodo Boydenove komore, kjer smo celice po tretmaju s heparinazo C različno spirali, je lahko odraz sprostitve kemokinov iz nevtrofilcev zaradi mehaničnega stresa. Glede na razlike v rezultatih kvantitativne verižne reakcije s polimerazo med nevtrofilci in monociti, bi lahko bil to razlog za njihovo različno migracijo. Potrebne bi bile nadaljnje raziskave kemotakse z monociti. Z metodo transendotelijske migracije smo potrdili rezultate metode Boydenove komore, in sicer da glikozaminoglikani na površini nevtrofilcev res prispevajo k njihovi kemotaksi. Dodatno smo pokazali, da po razgradnji glikozaminoglikanov na endotelijskih celicah migracija zelo upade. S tem smo dokazali, da imajo endotelijski glikozaminoglikani večjo vlogo kot glikozaminoglikani na površini nevtrofilcev. Kemokini in glikozaminoglikani predstavljajo pomembne tarče za terapijo vnetja, zato je potrebno na tem področju več raziskav, da bi bolje razumeli vlogo glikozaminoglikanov na levkocitih na njihovo migracijo.
|
