Rak dojke je najpogostejša malignost pri ženskah, saj je letno na svetu diagnosticiranih več kot
1,5 milijona novih primerov bolezni. Opredeljeni so bili različni dejavniki tveganja, kot so hormonski in genski dejavniki ter življenjski slog, za katere je dokazano, da povečujejo verjetnost za nastanek raka dojke.
Glede na prisotnost molekularnega markerja so opredeljeni trije podtipi bolezni: za hormonski receptor pozitivni (HR+), za humani epidermalni rastni faktor 2 pozitivni (HER2+) in trojno negativni rak dojke. Podtipi delujejo kot vodilo pri diagnozi, prognozi in sistematičnem zdravljenju bolezni. Sistematično zdravljenje se uporablja za zaustavitev razvoja in preprečitev ponovitve bolezni.
Najpogostejši podtip raka dojke je HR+, s prevalenco med 60 in 70 %. Znotraj podtipa HR+ je opaženo izražanje estrogenskega (ER) in progesteronskega receptorja (PR), ki služita kot markera in tarči za zdravljenje. Standardno sistemsko terapijo sestavljajo zaviralci jajčnikov (OS), inhibitorji aromataze (AIs) in selektivni modulatorji estrogenskih receptorjev (SERM). Tamoksifen (TAM), nesteroidni antagonist ER, ki ima sposobnost vezave na ER-receptorje v nanomolarni koncentraciji, je najbolj pogosto uporabljeno zdravilo za HR+ rak dojke.
Drugi najpogostejši podtip je HER2+, s prevalenco med 20 in 30 %. Značilno je prekomerno izražanje receptorja HER2. Zlati standard v zdravljenju podtipa HER2+ je humanizirano monoklonsko protitelo, ki cilja zunajcelično domeno HER2, trastuzumab (blagovna znamka Herceptin, HER). Pred razvojem trastuzumaba je bil zaradi pomanjkanja sistemske terapije ta fenotip povezan z zelo slabo prognozo.
Tretji znani podtip je trojno negativni rak dojke, ki je najmanj pogost, a najbolj agresiven fenotip, povezan s slabo prognozo. V primerjavi s podtipoma ER+ in HER2+ trojno negativni rak nima molekularne tarče, ki bi zavrla razvoj bolezni. Standardna terapija pri trojno negativnem raku je kombinacija kemoterapije in radioterapije. Cisplatin (CIS) je eden od prvih odkritih kemoterapevtikov s klinično uporabo iz poznih sedemdestih let prejšnjega stoletja. CIS zavira celično delitev s tvorbo dvojnih prelomov DNA, ki jih rakave celice ne morejo uspešno popraviti zaradi pogosto mutiranih mehanizmov popravljanja poškodb DNA.
Endokanabinoidni sistem (ECS) je sestavljen iz kanabinoidnih receptorjev (CBs), endogenih kanabinoidov in encimov, vključenih v biosintzne in razgradne poti endokanabinoidov. Doslej so odkrili dve vrsti receptorjev: kanabinoidni receptor tipa 1 (CB1) in kanabinoidni receptor tipa 2 (CB2). Oba receptorja sta povezana z G-proteini (GPCR), in sodelujeta pri različnih celičnih mehanizmih in v nevronih pri kognitivnih procesih.
CB1 je bil prvi odkriti receptor ECS, ki vsebuje 2 znani izoobliki, se je pretežno izraža v centralnem in perifernem živčnem sistemu. Izražanje ni omejeno samo na živčni sistem, prisotno je tudi v drugih perifernih tkivih, kot so kardiovaskularni, gastrointestinalni, imunski sistem itd. Vloga CB1 v perifernih tivih še ni dovolj poznana. Dokazano je, da je receptor CB1 lokaliziran na plazemski membrani, vendar so raziskave pokazale, da obstajajo internalizirani (endosomi) in intracelularni predvsem mitohondrijski, pa tudi lizosomski receptorji. Po aktivaciji CB1 lahko deluje inhibitorno ali aktivacijsko na različne encime in signalne poti, ki posledično spodbujajo celično preživetje ali smrt, odvisno od vrste vezanega liganda in celičnega okolja.
Drugi odkriti receptor ECS je CB2, ki se enako nahaja v dveh znanih izooblikah in se pretežno izraža v imunskem sistemu (v celicah, kot so bazofilci, eozinofilci, NK-celice, nevtrofilci, makrofagi, itd.). Nove raziskave so pokazale, da je receptor CB2 prisoten tudi v periferiji in v možganih. Čeprav signalne poti CB2 niso tako dobro poznane kot pri CB1, je glavna vloga CB2 pri sprožitvi provnetnih ali protivnetnih učinkov imunskih celic.
Obstajajo tri vrste spojin, ki lahko sprožijo aktivacijo ECS: endokanabinoidi, fitokanabinoidi in sintetični kanabinoidi. Endokanabinoidi so endogeno sintetizirane signalne lipidne molekule, ki imajo sposobnost vezave na CB-receptorje. Anandamid (AEA) in 2-arahidonoilglicerol (2-AG) sta najbolj znana endokanabinoida, ki delujeta kot agonista CB-receptorjev, imata različne lastnosti, način delovanja, pot sinteze in razgradnje. Fitokanabinoide najdemo pretežno v rastlini C.sativa L., ki vsebuje več kot 120 kanabinoidov. Najbolj pogost fitokanabinoid je
Δ9-tetrahidrokanabinol (Δ9-THC), psihoaktivna spojina, in kanabidiol (CBD), ki je zaradi svojih potencialnih terapevtskih lastnosti postal zanimiv v zadnjih letih. Tretja vrsta kanabinoidov so sintetični kanabinoidi, ki so sintetizirani mimetiki fito in endokanabinoidov. Sintetične kanabinoide so razvili za eksperimentalne in terapevtske namene.
Povezava med ECS in njegovim potencialom kot terapevtsko tarčo so prvič opazili pred 35 leti. Pri nekaterih boleznih je ECS spremenjen, stopnje izražanja CB-receptorjev so različne, prav tako ravni endokanabinoidov. Danes obstajajo dokazi o pozitivnih učinkih kanabinoidov pri zdravljenju nevropatske bolečine, multiple skleroze (MS), epilepsije in raka (paliativno zdravljenje). Pri zdravljenju zgoraj navedenih patologij je bilo odobrenih več zdravil na osnovi kanabinoidov, kot so Nabilon, Dronabinol, Nabiximols, itd.
Potencial kanabinoidov pri zdravljenju intenzivo proučuje, klinična preskušanja pa potekajo pri boleznih z različnimi nevrološkimi motnjami (Parkinsonova, Alzheimerjeva, Huntingtonova), psihičnimi motnjami, posttravmatskimi stresnimi motnjami (PTSP), Tourettovim sindromom, anksioznimi motnjami, glavkomu in raku (možgani, dojka, prostata, kosti, koža, maternični vrat, trebušna slinavka, levkemija itd.).
Razen paliativne terapije raka so različni in vivo ter in vitro poskusi pokazali, da imajo kanabinoidi protitumorske učinke ter da vplivajo na celične procese, kot so celični cikel, proliferacija, smrt, migracija/invazija rakavih celic in angiogeneza/metastaziranje.
Namen dela, cilji in hipoteze
V magistrskem delu smo želeli (1) določiti ravni izražanja kanabinoidnih receptorjev in (2) učinke samega kanabidiola (CBD) ali v kombinaciji s pogostim za fenotip specifičnim terapevtikom na izbrane celice raka dojke. Predpostavili smo, da bosta raven izražanja receptorjev CB1 in CB2 ustrezala biološkim vplivom CBD-ja na preživetje celic.
Rezultati
Ad 1. V sklopu naloge smo preizkusili eno od najbolj uporabljenih komercialnih poliklonskih protiteles proti CB1 in proti CB2 (proizvajalca Abcam) in bili med prvimi, ki smo testirali novo monoklonsko protitelo proti CB1 in proti CB2 (proizvajalca Santa Cruz Biotechnology). Določili smo specifičnost izbranih protiteles in ovrednotili izražanje CB1 in CB2 v izbranih celičnih linijah raka dojke različnih podtipov in z različnim statusom receptorjev. Izbrali smo humane nesmrtne celične linije raka dojke: MCF-7 (ER+/PR+/HER2-), MDA-MB-231 (trojno-negativna), MDA-MB-361 (ER+/PR+/HER2-), SK-BR-3 (ER-/PR-/HER2+) in T-47D (ER+/PR+/HER2-). Celice smo gojili po protokolih ATCC in dobili pričakovane morfologije.
Izražanje CB-receptorjev smo določili z dvema izbranima metodama: z metodo prenosa western (WB) in imunocitokemijo (ICC). Za analizo s prenosom western smo iz celičnih linij pridobili celične oborine, iz katerih smo ekstrahirali proteine z RIPA pufrom. Za pozitivne kontrolne celice smo izbrali nerakotvorno celično linijo MCF-10 in celice, izolirane iz pacienta z možganskim tumorjem (glioblastomom). Oba seta protiteles se vežeta na CB1 in CB2, a z različnima intenzitetama v izbranih celičnih linijah raka dojke. Protitelo proti CB1 podjetja Abcam lahko zazna CB1 samo v dimerni obliki, s signali, ki ustrezajo dvojni molekulski masi CB1. Pri protitelesu proti CB2 proizvajalca Abcam opazimo dimerne in monomerne signale. Protitelesa proti CB1 in CB2 proizvajalca Santa Cruz uspešno zaznajo signale specifične velikosti za
CB-receptorje. Rezultate smo kvantificirali in normalizirali glede na hišni protein GAPDH.
Tu prvič poročamo o izražanju CB-receptorjev v celičnih linijah SK-BR-3 in MDA-MB-361. Pokazali smo, da poleg CB2 celice SK-BR-3 izražajo tudi CB1. Pokazali smo tudi, da celična linija MDA-MB-361 izraža oba CB-receptorja, vendar z različno intenzivnostjo. Pri imunocitokemijskih rezultatih ni bilo enotnega obarvanja med testiranima celičnima linijama raka dojk. Protitelesa podjetja Santa Cruz proti CB1 so neustrezna za metodo ICC in rezultati niso primerljivi z WB. Pri Abcamovom protitelesu proti CB1 in Santa Cruzovemu proti CB2 smo opazili signal, vendar je potrebna dodatna validacija zaradi nespecifičnosti in opažene neobičajne lokalizacije (jedrno barvanje).
Ad 2. Drugi cilj naloge je bil ugotoviti vpliv CBD na celično viabilnost, samostojno ali kombinaciji z specifičnim terapevtikom, kar smo določali s testom MTT. Za ER+ smo zbrali linijo T-47D in terapevtik tamoksifen, za HER+ SK-BR-3 in terapevtik Herceptin ter za trojno negativno
MDA-MB-231 in terapevtik cisplatin.
Metabolni testi so pokazali, da CBD zmanjšajo viabilnost celic v vseh testiranih celičnih linijah, bodisi na način, ki je odvisen od koncentracije (T-47D) ali praga odgovora (SK-BR-3,
MDA-MB-231). Za vse tri linije smo izračunali vrednosti IC50 za CBD. Po našem vedenju smo bili prvi, ki smo testirali in prikazali CBD v kombinacijski terapiji z zgoraj navedenimi terapevtiki (TAM, HER, CIS). Možen sinergizem med CBD in terapevtiki smo opazili v vseh preizkušenih celičnih linijah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave vpliva ECS pri zdravljenju raka dojke.
|
