Encimi MurA, MurB in MurC katalizirajo začetne stopnje citoplazmatske biosinteze peptidoglikana. Za Mur ligaze je značilno, da ohranjene med različnimi vrstami bakterij, kar predstavlja velik potencial, da postanejo tarče za nove razrede antimikrobnih sredstev. Glavni cilj te študije je bila produkcija rekombinantnih MurA in MurB ligaz iz C. difficile in testiranje potencialnih inhibitorjev, izoliranih iz rodu Streptomyces sp. V ta namen smo murA in murB gene klonirali iz Clostridium difficile DNA, pomembnega javnega zdravstvenega patogena. Klonirani proteini so bili izraženi v žuželčjih celicah Spodoptera frugiperda in Escherichia coli. Dobljene proteine smo očistili z uporabo His tag afinitetne kromatografije in kot drugo stopnjo čiščenja z izključitveno kromatografijo. Vzporedno smo klonirali tudi kodon optimizirane sintetične MurA, MurB in MurC, za primerjavo kloniranja iz naravne in sintetične DNA. Slednje se je izkazalo za uspešnejše v tem raziskovalnem delu zaradi optimizacije DNA za ekspresijo v celicah žuželk in E. coli. Vsebnost beljakovin smo analizirali z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu SDS-page in Western blot. Za določitev aktivnosti očiščenega rekombinantnega MurA proteina smo uporabili inhibitorni test in potrdili katalitično aktivnost MurA. Ekstrakti iz rodu Streptomyces sp. so bili testirani, kot potencialni inhibitorji proti prekomerno izraženi MurA ligazi iz C. difficile . Kot pozitivno kontrolo smo uporabili fosfomicin, znan antibiotik proti MurA ligazi. Glede na rezultate Streptomyces ekstrakti niso pokazali inhibitorno aktivnost proti MurA ligazi.
|
