VISOKOENERGIJSKA NAPRAVA ZA REVERZIBILNO IN IREVERZIBILNO ELEKTROPORACIJO CELIČNE MEMBRANE

FLISAR, KAREL (author), Miklavčič, Damijan (mentor), Vončina, Danjel (co-mentor)

Celica, izpostavljena električnemu polju, spremeni svoje lastnosti, kar se kaže tudi v povečani prepustnosti celične membrane. Temu pojavu pravimo elektropermeabilizacija ali tudi elektroporacija. Ta pojav se uspešno uporablja v medicini, kjer povečana prepustnost membrane omogoči povečan vnos zdravil v celico in tako znatno poveča učinek zdravljenja. Takšno terapijo imenujemo elektrokemoterapija. Pojav elektropermeabilizacije se uporablja tudi za vnos genov v celico, pa tudi na ostalih področjih, kot so predelava hrane, uničevanje mikroorganizmov in v nekaterih biotehnoloških postopkih. Naprave, s katerimi dovajamo električne pulze, s katerimi zagotavljamo elektroporacijo membran, imenujemo elektroporatorji. Po namembnosti in uporabi jih razdelimo v dve skupini: v naprave za laboratorijsko in medicinsko uporabo ter naprave za industrijsko uporabo. Za prvo skupino naprav je značilno, da so praviloma namenjene dovajanju omejenega števila pulzov. Druga skupina naprav je namenjena neprekinjenemu (trajnemu) delovanju in od prej omenjene skupine (laboratorijskih in medicinskih naprav) odstopa predvsem po večji moči in maksimalnih amplitudah napetosti, vendar pa imajo običajno skromne možnosti spreminjanja ostalih parametrov elektroporacije (širina pulza, oblika pulza, ponavljalna frekvenca pulza). Med skupino laboratorijskih naprav in skupino industrijskih naprav obstaja vrzel: na trgu namreč ni na voljo naprav, ki bi združevale nekatere lastnosti (npr. fleksibilnost, kompaktnost/prenosljivost) laboratorijskih naprav in energetsko zmogljivost industrijskih naprav. Načrtovanje in gradnja industrijskih naprav sta uspešni, če se prej opravijo številni poskusi v laboratorijskem okolju. Včasih je potrebno ponoviti nekatere poskuse tudi v industrijskem okolju. Zato je ena od zelo pomembnih lastnosti naprave, ki bi jo lahko uporabljali v obeh okoljih, njena mobilnost, kar poenostavljeno pomeni, da jo lahko premeščamo brez posebnih pomagal. Druga pomembna lastnost takšne naprave je zmožnost neprekinjenega delovanja in doseganje električnih parametrov v širokem razponu parametrov pulzov in tudi aplikacij, ki omogočijo tudi ireverzibilno elektroporacijo, to je postopek, pri katerem celica zaradi visokega električnega polja in vnosa energije odmre. Fleksibilnost, prenosljivost in možnost neprekinjenega delovanja so bile osnovne smernice, ki so nas vodile pri načrtovanju laboratorijske naprave za neprekinjeno delovanje. Na podlagi temeljite analize smo se odločili za razvoj naprave, ki bo omogočila dovajanje pulzov pravokotne oblike v območju: napetosti od 0 do 5000 V, pulzov od 10 μs do 10 ms in ponavljalne frekvence do 100 Hz, in ki bo torej omogočalo natančno analizo povezave med učinki elektroporacije in uporabljenimi parametri, kot so napetost, tok in vnešena energija. Med možnimi tehničnimi variantami generiranja visokonapetostnih pulzov smo se odločili za generiranje pulzov s visokonapetostnim stikalom, ki je realizirano s serijsko vezavo transistorjev. Ta izvedba omogoča tudi (skoraj) poljubno nadgradnjo v smeri višjih izhodnih napetosti ob uporabi na trgu dostopnih in relativno poceni komponent. Ker je stikalo krmiljeno z optičnimi vlakni, je to tudi pomemben nastavek v smeri gradnje industrijske naprave. Drugi ključni del naprave je vir visoke napetosti, ki je bil v preizkusnem obdobju realiziran z uporabo nastavljivega transformatorja (variaka) in visokonapetostnega ločilnega transformatorja. Verjetno je največ težav in ovir pri gradnji ter preizkušanju naprave povzročila pomanjkljiva izbira materiala in komponent, primernih za uporabo v visokonapetostnem okolju, in pomanjkanje izkušenj, kar pa smo v letih razvoja naprave uspešno prebrodili. V okviru naloge sem zgradil dve napravi: napravo PBp in napravo Bruno. V slednji smo uporabili vse izkušnje, ki smo jih pridobili pri gradnji in uporabi prve naprave. Z napravama smo naredili več kot 1500 poskusov v laboratorijskem in polindustrijskem okolju na področjih, kot so: inaktivacija mikroorganizmov, ekstrakcija snovi iz celic, vnos genskega materiala v celice in poskusov priprave materialov za industrijske procese (impregnacija lesa). Pri poskusih s pretočnimi sistemi smo uporabljali pretočne komore, izdelal jih je dr. G. Pataro na Univerzi v Salernu, vendar smo se na podlagi izkušenj lotili razvoja in izdelave lastnih komor. Z novo konstrukcijo bomo zmanjšali korozijo elektrod, dosegli boljše tesnjenje komore in možnost izpostavitve vzorcev/celic večjemu električnemu polju.

• Language: Slovenian
• Keywords: elektropermeabilizacija, ireverzibilna elektroporacija, serijska vezava transistorjev, pretočna komora, ekstracija snovi iz celic, inaktivacija mikroorganizmov, vnos genskega materiala v celico
• Work type: Doctoral dissertation
• Organization: FE - Faculty of Electrical Engineering
• Year: 2017
• PID: 20.500.12556/RUL-96788
• COBISS.SI-ID: 11883860
• Publication date in RUL: 16.10.2017

Secondary language

• Language: English
• Title: HIGH-ENERGY DEVICE FOR REVERSIBLE AND IRREVERSIBLE ELECTROPORATION OF THE CELL MEMBRANE

Abstract

Membrane electropermeabilitation or electroporation is a phenomenon which causes the membrane of the cell to increase its permeability when subjected to a high electric field. This technique is used with great success in electrochemotherapy. The increased permeability of the cell membranes enables better cellular uptake of specific chemotherapevtic drugs which significantly increases its effectiveness. Electroporation is also used in gene transfection, food processing technologies, removal of the microorganisms and other industrial processes. Devices for generating high voltage electric pulses are often called electroporators. Based on their field of operation, we can classify them in two categories: devices for laboratory and medical use and devices for industrial (mostly food) processing. In general the appliances, which fall under the first categories, are known to have discontinued operation and generate a limited number of electric pulses. The second category of devices enables continuous (uninterrupted) operation while providing higher energy and amplitude of electric pulses, but come with a cost of limited versatility pulse parameters. Because the intended purpose of the electroporators is so different, there is a lack of electroporators avallability which can be versatile in generating electric pulses while providing continuous operation and have electric efficiency of industrial grade electroporators. Operation of industrial grade electroporators is more efficient if it is thoroughly tested in a controlled environment in laboratories. For this reason, it is of great benefit if the electroporator unit is mobile, that is, if it can be easily transferred between different places of operation. The second important characteristic of such devices is the ability of continuous operation and the flexibility for generating different electric pulses for electroporation, where the cells are subjected to high electric field and very high energy pulses to create permanent and hence lethal changes in the cells. The focus of the thesis was the design of a device for electroporation, which generates square shaped electric pulses, which offer better possibility to analyse relationship between the electroporation effects and the parameters of the electric pulses. The choice for generating electric pulses with the use of high voltage switching devices connected in series was selected among different possible concepts for generating high voltage electric pulses. This choice also enables almost unlimited future upgrades in terms of increasing the output voltage while using commercially accessible high voltage switching elements. The most important aspect when designing the semi-industrial electroporator is driving the high voltage switching elements with the use of optical fibers, which provides galvanic insulation between the control board and power components. The second important aspect is the high voltage source, which was realized with the variable transformer and high voltage insulation transformer. In the framework of the thesis two electroporators named “PBp” and “Bruno” were built. Bruno was built on the basis of the experience obtained and based on PBp with various technical upgrades and improvements. Together both electroporators were successfully used in more than 1500 experiments either in the laboratory or semi-industrial environment where we focused on microorganism deactivation, extraction of proteins and other molecules fom cells, gene transfection and experiments for wood impregnation. With the experiments on flow systems, we started with using flow chambers provided to us and developed by G. Pataro and colegues from University of Salerno. However based on experience gained we later developed our own flow chamber. With the constructed flow chamber, we were able to reduce the corrosion of electrodes, achieve better seal of the chamber, which at the same time, enabled us to use much higher electric fields.

• Keywords: electro permeabilization, irreversible electroporation, in series connected switching devices, flow chamber, extraction, microorganism deactivation, gene transfection