Razvozlavanje vloge izločanja IL4i1 iz dendritičnih celic z visoko ekspresijo receptorja CD5

Povšin, Jure (author), Gaber, Aljaž (mentor), Murray, Peter (comentor)

Imunski sistem je povezan skupek celic in molekul, ki ščiti organizem pred patogenimi organizmi, vključno z virusi, bakterijami, glivicami in paraziti. Poleg obrambe pred okužbami ima imunski sistem pomembno vlogo pri odstranjevanju nenormalnih (rakavih) celic, uravnavanju vnetij ter pospeševanju celjenja ran in obnove tkiv. Imunski sistem lahko na splošno razdelimo na dve glavni komponenti: prirojeni imunski sistem, ki zagotavlja takojšnjo in nespecifično obrambo, ter pridobljeni imunski sistem, ki s pomočjo spominskih celic razvije usmerjen odziv na specifične patogene, s katerimi se je predhodno že srečal. Prirojeni imunski sistem je prva obrambna linija telesa pred patogenimi organizmi in njegove glavne komponente so fizične in kemične bariere, prirojene imunske celice in krvni proteini (proteini komplementa in citokini). Najpomembnejše celice so fagociti, kot recimo nevtrofilci in makrofagi, dendritične celice (DC), naravne celice ubijalke ter mastociti. Značilnost prirojenega imunskega sistema so receptorji PRR (ang. patern recognition receptors), ki prepoznajo molekularne vzorce PAMP (ang. pathogen-associated molecular patterns) in DAMP (ang. damage-associated molecular patterns) na različnih patogenih. Prirojen imunski sistem je tudi odgovoren za aktivacijo pridobljenega imunskega sistema, predvsem preko dendritičnih celic. Za pridobljeni imunski sistem je značilna specifičnost za tuje antigene, spomin na predhodno srečane antigene in nereaktivnost na lastne antigene. Sistem vključuje dve glavni vrsti: humoralno imunost, ki jo posredujejo protitelesa, ki jih proizvajajo celice B, in celično posredovano imunost preko celic T. Med slednje spadajo celice T pomagalke (CD4+ celice T) ter citotoksične celice T (CD8+ celice T). Celice T pomagalke preko citokinov aktivirajo in usmerjajo druge celice imunskega odziva (npr. makrofage in celice B). Citotoksične celice T pa neposredno zaznajo in ubijejo okužene ali rakave celice s prepoznavanjem specifičnih antigenov, ki so predstavljeni na molekulah glavnega histokompatibilnostnega kompleksa (ang. MHC). Dendritične celice so profesionalne antigen predstavitvene celice in imajo ključno vlogo pri povezovanju prirojenega in pridobljenega imunskega sistema, saj vplivajo na aktivacijo in diferenciacijo celic T. Poznamo klasične ali konvencionalne DC (ang. cDCs), plazmacitoidne DC (ang. pDCs) in DC, ki izvirajo iz monocitov (ang. Mo-DCs). Klasične dendritične celice se delijo še na tip 1 (ang. cDC1) in tip 2 (ang. cDC2). Glavna funkcija tipa 1 je navzkrižna predstavitev antigena citotoksičnim celicam T prek njihovega receptorja MHC I. Na ta način pomagajo pri odstranjevanju znotrajceličnih patogenov in imajo tudi protitumorske lastnosti. Tip 2 pomaga pri obrambi pred zunajceličnimi patogeni s predstavitvijo antigenov preko receptorja MHC II celicam T pomagalkam. Glavna funkcija plazmacitoidnih DC je proizvodnja interferonov tipa I (INF-α in INF-β), ki na tak način pomagajo pri protivirusni in protitumorski imunosti. Dendritične celice, ki izvirajo iz monocitov, imajo vlogo v imunskih odzivih, zlasti med vnetjem in okužbami. Do danes je enotna klasifikacija dendritičnih celic še vedno izziv, saj se zaradi napredka v tehnologiji (npr. uporaba sekvenciranja mRNA posameznih celic) odkriva vedno nove podvrste, ki jih različni raziskovalci med seboj poimenujejo z drugačnimi imeni. Različne podskupine DC je mogoče opredeliti s posebnimi površinskimi označevalci. Pri ljudeh in miših sta glavna označevalca za cDC1 XCR1 in CLEC9A. Za cDC2 so značilni označevalci CD11b, CD11c in CD172A (znan tudi kot SIRPα). Te označevalce smo uporabili pri našem delu za natančno identifikacijo in razlikovanje med različnimi podskupinami dendritičnih celic. Dendritične celice se nahajajo v dveh stanjih: nezrele in zrele. Le zrele DC lahko aktivirajo celice T in tako sprožijo pridobljeni imunski odziv. Zorenje se sproži, ko nezrela DC preko svojih PRR zazna PAMP ali DAMP. Po aktivaciji dendritične celice doživijo vrsto sprememb, ki povečajo njihovo sposobnost predstavljanja antigenov in aktivacije celic T. Iz podatkov, pridobljenih v našem laboratoriju (od Leonie Zeitler in Charlotte Duteil), vemo, da lahko aktiviramo klasične DC z uporabo agonistov TLR (ang. Toll-like receptor) kot so recimo CpG, Poly I:C in LPS. Vsi ti agonisti v DC povečajo tudi izražanje in izločanje encima za presnovo aromatskih aminokislin, imenovanega IL4i1 (ang. Interleukin-4-induced-1). IL4i1 je oksidaza L-amino kislin (ang. LAAO), ki katalizira oksidativno deaminacijo aromatskih L-amino kislin, pri čemer nastajajo α-keto kisline, vodikov peroksid (H2O2) in amonijak. Encim je bil sicer odkrit v celicah B, vendar so glavni proizvajalci IL4i1 najverjetneje mieloidne celice, zlasti makrofagi in dendritične celice. Encim se iz celic izloča, kar pomeni, da je aktiven v zunajceličem prostoru. IL4i1 izkazuje največjo afiniteto do fenilalanina (Phe), vendar presnavlja tudi tirozin (Tyr) in triptofan (Trp) ter posledično proizvaja fenilpiruvat (PP), 4-hidroksifenilpiruvat (4HPP) in indol-3-piruvat (I3P). Iz raziskav narejenih v našem laboratoriju in drugod je bilo ugotovljeno, da ima IL4i1 najverjetneje pomembno imunoregulatorno in imunosupresivno funkcijo, ki deluje protumorigeno. Preko porabljanja aromatskih aminokislin in posledično nastajanja aktivnih metabolitov encim zavira proliferacijo celic T, spodbuja diferenciacijo regulatornih celic T ter spodbuja nastanek M2 makrofagov, ki lahko pripomorejo k rasti tumorjev in angiogenezi. Zato ni nepričakovano, da je bil IL4i1 povezan z zmanjšanim imunskim odzivom na maligna obolenja in slabšim preživetjem pri različnih vrstah raka, vključno z gliomom, melanomom, rakom jajčnikov in ščitnice. Kljub temu, ostaja izražanje in izločanje IL4i1 ter njegova splošna biologija neraziskana, zlasti v okviru DC. Eden od receptorjev, ki jih lahko izražajo DC je tudi receptor CD5. Gre za transmembranski glikoprotein tipa I, ki ima ključno vlogo v imunskem sistemu, zlasti pri uravnavanju odziva celic T in B. V zadnjem času dobiva vedno več pozornosti, saj so raziskave pokazale, da DC, ki izražajo ta receptor učinkovitejše aktivirajo celice T kot DC, ki receptorja ne izražajo. Poleg tega so znanstveniki po pregledu mieloidnih predelov človeških limfnih vozlov v koži ugotovili, da je število DC z visoko ekspresijo receptorja CD5 v limfnih vozlih oseb z melanomom manjše kot v neprizadetih tkivih. Skladno s tem je bilo izražanje CD5 povezano z boljšim preživetjem in preživetjem brez ponovitve bolezni pri bolnikih z različnimi vrstami raka, vključno z melanomom. Njihove ugotovitve so razkrile ključno imunostimulatorno vlogo CD5 na DC, ki povečuje uspešno predstavitev antigena tumorsko reaktivnim celicam T, njihovo aktivacijo, proliferacijo, efektorske funkcije in odzive na zdravljenje z blokado imunskih kontrolnih točk (ang. ICB). Regulacija receptorja CD5 je bila povezana s prisotnostjo citokina IL-6 med razvojem dendritičnih celic. Še posebej nizke koncentracije IL-6 (pod 20 ng/ml), ki so bile prisotne med diferenciacijo DC, so povzročile povečano izražanje CD5 na podskupinah dendritičnih celic cDC1 in cDC2. Njihove ugotovitve kažejo, da CD5 na dendritičnih celicah deluje kot imunostimulacijski receptor, ki je ključen za povečano uspešno začetno predstavitev antigena protitumorskim celicam T, in razkrivajo novo strategijo za sprožitev odziva na zdravljenje z blokado imunskih kontrolnih točk. V tej magistrski nalogi smo preučevali medsebojni vpliv med IL4i1, potencialnim imunomodulatornim encimom, povezanim z napredovanjem tumorjev, in dendritičnimi celicami z visoko ekspresijo receptorja CD5, ki so bile povezane z izboljšano aktivacijo celic T ter boljšim preživetjem pri bolnikih z rakom. Glede na nasprotujoči si vlogi IL4i1 in DC z visoko ekspresijo receptorja CD5, je bila glavna hipoteza, da DC z visoko ekspresijo receptorja CD5 ne izražajo IL4i1 ali da so ravni izražanja nižje kot pri normalnih DC. Poleg tega smo želeli raziskati splošne biološke mehanizme med IL4i1 in DC z visoko ekspresijo receptorja CD5, saj je to področje, ki v trenutni imunološki literaturi še ni raziskano. Da bi preverili hipotezo, so bile DC z visoko ekspresijo receptorja CD5 ustvarjene in vitro iz mišjega kostnega mozga z uporabo nizke koncentracije citokina IL-6 (5 ng/ml) med postopkom diferenciacije DC. Rezultati so pokazali, da so DC z visoko ekspresijo receptorja CD5 imeli zmanjšano izražanje IL4i1 tako na proteinski kot na mRNA ravni. To znižanje je lahko povezano s signalnimi potmi, ki jih aktivira IL-6, ki bi lahko zavirale proizvodnjo IL4i1 in hkrati spodbujale diferenciacijo DC z visoko ekspresijo receptorja CD5. Nadaljnji poskusi so pokazali, da čas dodajanja IL-6 med procesom diferenciacije vpliva na izražanje IL4i1. Ko je bil IL-6 dodan na začetku diferenciacije DC, je bilo opaženo večje zmanjšanje encima, v primerjavi z dodajanjem IL-6 v kasnejših fazah. Učinek IL-6 na zmanjšanje IL4i1 torej upada, čim bolj so dendritične celice že diferenciirane. Poleg tega so bili raziskani učinki IL-6 na diferenciacijo običajnih podskupin DC, zlasti cDC1 in cDC2, ter na izražanje receptorja CD5. Rezultati so pokazali, da IL-6 zavira diferenciacijo cDC1, hkrati pa povečuje izražanje CD5. Natančneje, prej ko je bil IL-6 dodan med diferenciacijo DC, bolj je inhibiral diferenciacijo cDC1 in bolj je povečal izražanje receptorja CD5. Pokazano je bilo tudi, da se povečano izražanje receptorja CD5 zgodi v zadnjih treh dneh diferenciacije DC. Bolj kot so dendritične celice diferenciirane, večjo ekspresijo receptorja CD5 imajo, pod pogojem, da je med samim postopkom diferenciacije prisoten IL-6. Citokina IL-6 in IL-10 sta oba aktivirala JAK/STAT3 signalno pot, vendar IL-10 ni izkazal zmanjšanja vrednosti IL4i1, opaženega pri IL-6, kar kaže na vpletenost alternativnih regulativnih mehanizmov, ki jih posebej aktivira le IL-6. Poleg tega zaviranje signalne poti JAK/STAT3 z uporabo JAK1 in JAK2 inhibitorja Ruxolitiniba ni spremenilo učinka IL-6 na znižanje izražanja IL4i1, kar kaže na morebitno vpletenost drugih mehanizmov. Zanimiva ugotovitev je bila, da ko smo DC aktivirali z CpG, nismo več zasledili prisotnosti gp130 in IL-6Rα, ki sta receptorja potrebna za IL-6 signalizacijo. V literaturi ta pojav še ni opisan, tako da je možno, da gre za regulacijski mehanizem DC, da ko se enkrat aktivirajo, preprečijo IL-6 signalizacijo, ki bi potencialno lahko vplivala na proces zorjenja DC. Rezultati te magistrske naloge dajejo osnoven vpogled v biologijo med IL4i1 in DC z visokim izražanjem CD5, vendar so potrebni nadaljnji poskusi za celovitejšo razjasnitev tega področja in raziskovanje morebitnih medicinskih aplikacij.

• Language: Slovenian
• Keywords: dendritične celice, IL4i1, CD5, IL-6
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FKKT - Faculty of Chemistry and Chemical Technology
• Year: 2024
• PID: 20.500.12556/RUL-162988
• Publication date in RUL: 30.09.2024

Secondary language

• Language: English
• Title: Deciphering the role of IL4i1 secretion from CD5high expressing dendritic cells

Abstract

Dendritic cells (DCs) are essential professional antigen-presenting cells that play a critical role in connecting the innate and adaptive immune systems by influencing T cell activation and differentiation. This thesis investigated the interplay between IL4i1, a potential immunomodulatory enzyme associated with tumor progression, and CD5high expressing dendritic cells, which have been linked to enhanced T cell priming and improved survival outcomes in cancer patients. Given the opposing roles of IL4i1 and CD5high expressing DCs, the primary hypothesis was that CD5high expressing DCs do not express IL4i1 or that the expression levels are lower than in normal DCs. To test this hypothesis, CD5high expressing DCs were generated in vitro from mouse bone marrow using a low concentration of the cytokine IL-6 (5 ng/ mL) during the DC differentiation process. The results demonstrated that CD5high expressing DCs indeed displayed reduced IL4i1 expression at both the protein and mRNA levels. This downregulation may be linked to signaling pathways activated by IL-6, which could inhibit IL4i1 production while promoting the differentiation of CD5high expressing DCs. Further experiments revealed that the timing of IL-6 addition during the differentiation process influenced IL4i1 expression, with earlier administration leading to greater downregulation. Additionally, the effects of IL-6 on the differentiation of conventional DC subsets, particularly cDC1s and cDC2s, as well as the expression of CD5, were explored. The findings indicated that IL-6 inhibits cDC1 differentiation while also upregulating CD5 expression. Specifically, the earlier addition of IL-6 during DC differentiation resulted in greater inhibition of cDC1 differentiation and increased CD5 expression. Notably, while IL-10 also activated the JAK/STAT3 pathway, it did not replicate the downregulation of IL4i1 observed with IL-6, suggesting the involvement of alternative regulatory mechanisms specifically activated by IL-6. Moreover, inhibiting the JAK/STAT3 signaling pathway using Ruxolitinib did not reverse the IL-6 downregulation effect on IL4i1 expression, indicating other mechanisms' potential involvement. These insights into the relationship between IL4i1 and CD5high expressing DCs provide a foundational understanding of the biological mechanisms involved. However, further experimentation is needed to elucidate this field more comprehensively and explore the potential medical implications.

• Keywords: dendritic cells, IL4i1, CD5, IL-6