Uravnavanje delovanja sesalskih celic preko načrtovane oligomerizacije svežnja štirih proteinskih vijačnic

Merljak, Estera (author), Gradišar, Helena (mentor), Jerala, Roman (comentor)

Sposobnost načrtovanja proteinskih interakcij predstavlja pomembno orodje pri ustvarjanju sintetičnih omrežij za uravnavanje celičnega odziva in številnih drugih funkcij, kot sta lokalizacija in sestavljanje kompleksnih celičnih struktur. Dodatna orodja za uravnavanje tvorbe proteinskih kompleksov bi imela velik prispevek k znanosti, tako kot orodje za raziskave kot tudi za biotehnološke in biomedicinske aplikacije. Svežnji štirih vijačnic so proteinske strukture, primerne za de novo načrtovanje. Na podlagi osnovnega sestavljanja iz dveh domen, kjer vsaka domena obsega dve vijačnici, so svežnje štirih vijačnic predhodno uporabili za (hetero)dimerizacijo proteinov. V sklopu doktorskega dela smo preučevali potencial različnih segmentacij načrtovanega svežnja štirih vijačnic (4HB) kot modelne strukture za načrtovanje dimerizacijskih, trimerizacijskih in tetramerizacijskih modulov iz enega proteina. Z metodo segmentacije smo razširili repertoar ortogonalnih oligomerizacijskih domen iz ene same strukture 4HB, kar zmanjša potrebo po de novo načrtovanju podobnih struktur. Eksperimentalno smo preučili strategijo segmentacije na več svežnjih štirih vijačnic, s čimer smo želeli vpeljati široko uporabo strategije na podobne načrtovane strukture. Poleg možnosti priprave več oligomerizacijskih domen predstavlja segmentacija dodaten vpogled v prispevke posameznih ? vijačnic k tvorbi 4HB ter s tem prepoznavanje problematičnih področij za nadaljnjo optimizacijo načrtovanih struktur. Tovrstne informacije so bile pogosto spregledane v procesu ovrednotenja načrtovanih struktur, kjer je bilo glavno merilo uspešnosti načrtovanja stabilnost celotne strukture. Poleg svoje vrednosti za raziskovanje de novo načrtovanih struktur imajo novo ustvarjeni oligomerizacijski moduli potencial za različne biološke aplikacije. Tekom doktorskega dela smo sestavljanje oligomerizacijskih domen v načrtovano strukturo ovrednotili kot rekonstitucijo razcepljenega poročevalskega proteina kresničkine luciferaze. Pripravljene module smo uporabili za posredovanje informacij različnih bioloških procesov v sesalskih celicah preko izgradnje sintezno-bioloških sistemov za: sočasno in neodvisno uravnavanje izražanja genov preko TALE-VP16 sistema; od rapaloga odvisno inducibilno aktivacijo rekonstitucije razcepljene kresničkine luciferaze ter vpeljavo SbMVp-PPVp proteazne kaskade; in sklopljeno zaznavanje CD19 ter CD20 ligandov na površini rakavih celic s prenosom signala v celice CAR-T na področju imunoterapije.

• Language: Slovenian
• Keywords: Sveženj štirih vijačnic, sintezna biologija, metoda segmentacije 4HB, oligomerizacijski moduli, uravnavanje delovanja sesalskih celic, inducibilno sestavljanje 4HB, CAR-T.
• Work type: Doctoral dissertation
• Organization: MF - Faculty of Medicine
• Year: 2023
• PID: 20.500.12556/RUL-151707
• Publication date in RUL: 18.10.2023

Secondary language

• Language: English
• Title: Regulation of mammalian cell behavior trough designed four-helical bundle protein oligomerization

Abstract

The ability to design synthetic protein-protein interactions provides an important tool in creating synthetic networks for the regulation of the cellular response and numerous other functions, such as localization and construction of cellular structures. Additional tools for the regulation of protein assemblies would have strong impact on science, both as a tool for research as well as for versatile applications, from biotech to therapy. Four helical bundles are protein domains that can be designed and have been used to mediate protein (hetero)dimerization based on splitting them into two subdomains each comprising two helices. For this PhD work we decided to further investigate the potentials of diverse segmentation strategy of a de novo designed four helical bundle (4HB) as a platform for generation dimerization, trimerization and tetramerization modules from a single protein. Segmentation strategy can thus extend the repertoire of orthogonal oligomerization domains from a single 4HB structures and reduces the need for de novo designs. We provide a demonstration of generalizability of segmentation strategy on several four helical bundles. Additionally, segmentation provides further detail in four helical bundle structure assembly and contribution of each of the four single peptides to its formation. This information has been often overlooked in the protein design workflow, where only the stability of final structure is assessed. In addition to its value for the investigation of designed structures, newly generated oligomerization modules have potentials for diverse biological applications. We have evaluated the level of affinity of designed oligomerization modules and reconstitution into designed four helical bundle based on split firefly luciferase reconstitution and activation. Further, we demonstrated in mammalian cells, that they can act as mediators of information towards diverse biological processes, such as: simultaneous and independent regulation of gene expression via the TALE-VP16 system; rapalog dependent inducible activation of split firefly luciferase reconstitution and construction of a SbMVp-PPVp protease cascade; and detection of CD19 and CD20 ligands on the surface of cancer cells with signal transduction into CAR-T cells in the field of immunotherapy.

• Keywords: Four helical bundle, 4HB, synthetic biology, segmentation strategy, oligomerization modules, regulation of mammalian cell behavior, inducible 4HB reconstitution, CAR-T cells.