Glicerol je alkohol, ki je prisoten v naravi in je najpreprostejši triol. Je enota, ki se nahaja v vsaki molekuli maščobe in olja. Uporablja se v različnih industrijah in je v zadnjem času postal izjemno pomemben, zaradi proizvodnje biogoriv. V prehrambni industriji se glicerol uporablja kot sladilo in topilo. V farmacevtski industriji se uporablja kot dodatek, ki izboljšuje okus raznih zdravil. Glicerol se uporablja tudi kot mazilo v različnih industrijah. Nekatere genetske bolezni lahko vplivajo na raven glicerola v krvi, zato je izjemno pomembno, da lahko določamo koncentracijo glicerola v vzorcu. Aktualne metode uporabljajo encime, ki spremenijo glicerol oziroma trigliceride v različne produkte, ki jih potem kvantitativno določamo. Te metode temeljijo na uporabi kolorimetričnih in kromatografskih tehnik.
Namen diplomskega dela je bil poiskati metodo, ki uporablja molekularno fluorescenčno spektrometrijo za določanje koncentracije glicerola v vzorcu. Najprej sem določil nekaj kriterijev za ovrednotenje aktualnih metod. Metoda je morala biti občutljiva, postopek pa preprost, hiter in izvedljiv z dostopnimi kemikalijami. Izbrana metoda je morala biti združljiva z molekularno fluorescenčno spektrometrijo.
Izbral sem metodo, ki je bila izvedljiva z molekularno absorpcijsko spektrometrijo in je že bila potrjena za uporabo z molekularno fluorescenčno spektrometrijo. Pri tej metodi sintetiziramo formaldehid iz glicerola, iz katerega lahko sintetiziramo fluorescentno molekulo. Metoda zahteva splošne dostopne kemikalije in je lahko izvedljiva. V članku, ki opisuje to metodo, so potrdili, da je le-ta natančna in točna. Edina spremenljivka, ki sem jo moral spremeniti, je bila koncentracija glicerola, iz katere sem določil linearno območje.
Najprej sem preveril, ali se je merjena fluorescenčna intenziteta povečala, če sem zvišal koncentracijo glicerola. To sem potrdil tako, da sem pripravil nekaj standardnih raztopin z isto koncentracijo glicerola, ki je bila uporabljena v originalnem članku. Potem sem izvedel eksperiment na enak način kot v članku, le da sem uporabil fluorescenčni spektrometer za analizo raztopin. Nato sem določil območje linearnega obnašanja metode. Ker je originalna metoda temeljila na uporabi molekularne absorpcijske spektrometrije za določanje koncentracije analita, sem moral zmanjšati koncentracije glicerola v standardnih raztopinah, saj je molekularna fluorescenčna spektrometrija izvedljiva le pri nizkih koncentracijah. Koncentracijo glicerola v standardnih raztopinah sem nekajkrat zmanjšal in določil območje, kjer je zveza med fluorescenčno intenziteto in koncentracijo analita linearna. Določil sem tudi mejo zaznavnosti in mejo določljivosti. Za ovrednotenje teh mej obstaja več načinov, jaz sem izbral računski način. Prvo sem določil na podlagi standardnega odmika merilne vrednosti. To sem naredil tako, da sem večkrat analiziral standardno raztopino in izračunal standardni odmik. Standardni odmik intenzitete sem potem delil z naklonom premice. To vrednost sem pomnožil s faktorjem 3, da sem dobil mejo zaznavnosti in s faktorjem 10, da sem dobil mejo določljivosti.
Nato sem večkrat analiziral pripravljene modelne vzorce z različnimi koncentracijami glicerola. S tem sem lahko ovrednotil ponovljivost metode. Izmerjena koncentracija glicerola je bila višja kot teoretična. Relativna napaka je bila približno +5 %. Razlogov za takšno napako je lahko več. Glicerol v modelnih vzorcih je lahko bil čistejši kot tisti, ki sem ga uporabljal za pripravo kalibracijskih standardnih raztopin. Sledila je analiza modelnih vzorcev, ki so vsebovali citratni pufer. Iz rezultatov sem ugotovil, da je metoda ponovljiva, vendar citratni pufer vpliva na merjeno fluorescenčno intenziteto. Do te točke sem uporabljal slepi vzorec, ki je vseboval le delovno topilo in dodane reagente. Ugotovil sem, da moram uporabljati slepi vzorec, ki vsebuje citratni pufer s podobno koncentracijo kot pufer v vzorcu, če sem hotel natančno določiti koncentracijo glicerola v modelnem vzorcu. Ko sem uporabljal slepi vzorec, ki je vseboval citratni pufer, sem določil koncentracijo glicerola, ki je bila primerljiva s koncentracijo glicerola, določena v modelnih vzorcih brez pufra. Iz teh eksperimentov sem tudi ugotovil, da moram standardne raztopine za kalibracijsko krivuljo vsakič na novo pripravljati. Rezultati so pokazali, da se metoda lahko uporablja za analizo tovrstnih vzorcev.
Nenazadnje sem kvalitativno analiziral tri prave vzorce: vzorec X, Y in Z. Najprej sem preveril, če lahko določim koncentracijo glicerola, ki je nad mejo določljivosti. V vzorcu X sem dobil rezultat, ki je pokazal, da je vsebnost glicerola pod mejo zaznavnosti, pri vzorcu Y na meji določljivosti in pri vzorcu Z nad mejo določljivosti. Kvantitativno sem analiziral vzorca Y in Z. V teh dveh vzorcih sem določil, da je koncentracija glicerola prisotna nad mejo določljivosti in da je masa glicerola v posameznem vzorcu okoli 4 μg. Za potrditev, da vzorca vsebujeta toliko glicerola, bi bila koristna še potrditev z drugo neodvisno metodo.
Iz vseh rezultatov lahko sklepam, da je metoda, ki sem jo preučeval, primerna za določanje koncentracije glicerola v obravnavanem okolju. Naslednji korak bi bila analiza bolj kompleksnih modelnih vzorcev, da bi lahko videli, kako se metoda obnaša v prisotnosti drugih primesi.
|
