Mikro RNA v plazemskih vzorcih zdravih oseb in bolnikov z malignim gliomom : doktorska disertacija

Herman, Ana (author), Jeras, Matjaž (mentor), Gruden, Kristina (comentor)

Glioblastom �GBM� kljub številnim uveljavljenim diagnostičnim in prognostičnim biološkim označevalcem in novim načinom zdravljenja še vedno velja za eno izmed najagresivnejših oblik raka s slabo napovedjo. Med glavne razloge za to uvrščamo visoko infiltrativno sposobnost tovrstnih rakavih celic, ki lahko migrirajo v še neprizadete dele možganov, poleg tega pa lahko kirurško odstranimo le majhen delež okoliškega tkiva. Z zdravljenjem običajno ne dosežemo migrirajočih celic, zato se tumor pogosto ponovno pojavi. Za boljšo uspešnost zdravljenja je ključnega pomena čim hitrejša postavitev diagnoze, zato predstavlja odkrivanje novih bioloških označevalcev, ki bi jih lahko pravočasno določali v enostavno dostopnih bioloških vzorcih bolnikov z GBM pomemben cilj trenutnih raziskav. Z njihovo pomočjo bi morda lahko bolezen odkrili v dovolj zgodnji fazi, predstavljali pa bi tudi nove potencialne tarče za zdravljenje te zahrbtne bolezni. Želja po razvoju učinkovitejših načinov zdravljenja, s katerimi bi lahko zdravili GBM na celovitejši način in s tem morebiti delovali tudi na invazivne celice, je pripeljala do množice novih pristopov, kot so npr. imunsko zdravljenje, uporaba mezenhimskih matičnih celic MMC, ciljanje signalnih celičnih poti in nenazadnje tudi vplivanje na izražanje genov preko uravnavanja količine miRNA v obolelih celicah. Molekule miRNA imajo kratko, enovijačno strukturo in igrajo pomembno vlogo v posttranskripcijski regulaciji. Skupaj z majhnimi interferenčnimi molekulami RNA siRNA namreč sestavljajo regulacijski biološki sistem, ki nadzira začetek in trajanje izražanja posameznih genov v celici. MiRNA sodelujejo pri diferenciaciji in proliferaciji celic, uravnavajo njihovo morfogenezo, delovanje endokrinega sistema, metabolizma, apoptozo in druge pomembne procese v celici. Tako zmanjšana kot povišana ekspresija miRNA sta lahko povezani s številnimi boleznimi, med drugim tudi z rakom, zato predstavljajo pomembno skupino tako potencialnih bioloških označevalcev kot morda tudi terapevtskih tarč in samih terapevtikov. V naši raziskavi smo z digitalnim profiliranjem s pomočjo tehnologije nCounter® analizirali plazemske koncentracije 734 človeških in s človekom povezanih virusnih miRNA. Omenjena tehnologija temelji na uporabi zmesi lovilnih in poročevalskih sond za določen nabor zrelih miRNA. Na ta način lahko kvantitativno digitalno določimo profil izražanja posamezne miRNA, in sicer na podlagi fluorescenčnih kod, ki so značilne zanjo. Tehnologija nCounter® se je v primeru analize nizkih koncentracij miRNA izkazala za bistveno občutljivejšo od splošno uporabljane metode PCR v realnem času. V raziskavo smo vključili 16 zdravih posameznikov in 16 bolnikov z GBM. Prvim smo odvzeli vzorce krvi trikrat znotraj enega meseca, drugim pa na dan operacije tumorja, dan po njej in en teden kasneje. Pri tem smo identificirali 19 miRNA s statistično značilno različnimi plazemskimi nivoji pri GB, v primerjavi s skupino zdravih posameznikov, pri čemer so bile razlike med ravnmi pri bolnikih v primerjavi z zdravimi prostovoljci najmanj 2‐kratne. Poleg teh smo odkrili še 24 miRNA, ki so bile statistično značilno povezane s preživetjem bolnikov po operativnem posegu. S prekrivanjem skupine miRNA, ki so potencialne kandidatke za biološke označevalce z diagnostično vrednostjo s skupino tistih, povezanih s preživetjem, smo opredelili 10 takih, ki bi lahko imele tako diagnostičen kot tudi prognostičen pomen. To so hsa‐miR‐1260a, hsa‐miR‐302c‐3p, hsa‐miR‐484, hsa‐miR‐493‐3p, hsa‐miR‐514a‐3p, hsa‐miR‐592, hsa‐miR‐124‐3p, hsa‐miR‐145‐5p, hsa‐miR‐30a‐5p in hsa‐miR‐483‐5p. Dve izmed njih, in sicer hsa‐miR‐592 in hsa‐miR‐514a‐3p, ki ju do sedaj še niso povezali z GBM, predstavljata novi kandidatni molekuli za selektivno biološko označevanje bolezni. Poleg tega smo odkrili tudi 11 virusnih miRNA s statistično značilno razliko med plazemskimi koncentracijami v obeh primerjanih skupinah. Znano je, da virusne miRNA vplivajo na celični cikel ter zavirajo imunske odzive in apoptozo. Njihovo delovanje se pri bolnikih z rakom prepleta s signali specifičnega tumorskega mikrookolja ter z odzivi imunskega in nevroendokrinega sistema. Za boljšo biološko interpretacijo smo rezultate obdelali z bioinformacijskimi orodji, in sicer na podlagi rudarjenja podatkov in z izrisom genskih mrež ter tako poskusili umestiti kandidatne miRNA v za GBM značilne signalne poti, oziroma razkriti njihovo povezavo z oslabljenimi imunskimi odzivi, ki vodijo do napredovanja bolezni. Najbolj nazorno smo uspeli prikazati njihovo vpetost v signalni poti p53 in Rb. Prisotnost GBM se torej nedvomno kaže v spremenjenih vzorcih plazemskih nivojev miRNA, vključno z virusnimi, kar predstavlja možnost za njihovo klinično uporabo v bodoče. Vsekakor bo potrebno vlogo miRNA, ki se na osnovi naših izsledkov ponujajo kot kandidatke za biološke označevalce, pri nastanku in poteku GBM dodatno raziskati in potrditi v še obsežnejših kliničnih študijah na neodvisnih skupinah bolnikov.

• Language: Slovenian
• Keywords: centralni živčni sistem, rak (medicina), prognostični dejavniki, mikro RNA, plazemska koncentracija, bioinformatika, tehnologija nCounter
• Work type: Doctoral dissertation
• Typology: 2.08 - Doctoral Dissertation
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Place of publishing: Ljubljana
• Publisher: [A. Herman]
• Year: 2015
• Number of pages: 175 str.
• PID: 20.500.12556/RUL-143740
• UDC: 616-006.48:577.21(043.3)
• COBISS.SI-ID: 280326912
• Publication date in RUL: 11.01.2023

Secondary language

• Language: English
• Title: Micro RNA in plasma samples of healthy individuals and malignant glioma patients

Abstract

Glioblastoma multiforme GBM is one of the most aggressive cancers with poor prognosis in spite of a plethora of well established diagnostic and prognostic biomarkers and treatment modalities. Poor treatment outcome is commonly linked to the fact that GBM cells infiltrate other sections of the brain. Besides, relatively small amount of surrounding tissue can be surgically removed, possibly leaving some tumor cells in the neighbourhood. Migrated tumor cells are often not affected by the treatment causing frequent tumor reocurrences. Early diagnosis is therefore an essential factor for imporvment of the treatment outcome. Current goal is a search for novel biomarkers, possibly easily accessible and detectable in blood of GBM patients that would enable early diagnosis, reliable prognosis and represent potential therapeutic targets, leading to more efficient therapeutic interventions. Development of effective terapies that would treat the disease in a more comprehensive way has led to many novel approaches such as immune therapies, messenhymal stem cell treatments, targeting molecules, involved in signaling pathways and gene expression manipulation through leveling of miRNA concentrations in affected cells. MiRNA molecules are short single‐stranded molecules playing an important role in posttranscriptional regulation. Together with siRNA molecules they form a biological system of RNA interference that contols the beginning and duration of gene expression in cells. MiRNAs are involved in differentiation and proliferation of cells, they balance morphogenesis, endocrine system, metabolism, apoptosis and other important cell processes. Decreased or increased miRNA expression can be correlated to various diseases including cancer, thus, they are foreseen as significant biomarkers or even therapeutics. Our research includes digital profiling of total 734 human and viral miRNAs in blood plasma samples using nCounter® technology. It uses mixture of capture and reporter probes for chosen set of mature miRNAs. Expression profiles can be digitally quantified with flourescent codes specific for each individual miRNA. Analysis of small miRNA concentrations using nCounter® technology prooved to be more sensitive compared to commonly used method RT‐qPCR. Our study included 16 healthy individuals and 16 patients with GBM. Samples of healthy individuals were taken three times within a period of one month. GBM patients were sampled on the day of the surgery, day after it and one week later. We identified 19 miRNAs with significantly different plasma levels in GBM patients, as compared to healthy individuals with the limit difference of at least 2‐fold. Additionally 24 miRNA levels were significantly correlated with patients’ survival. Moreover, the overlap between the group of candidate miRNAs for diagnostic biomarkers and those associated with survival, consisted of 10 miRNAs with both, diagnostic and prognostic potential. These are hsa‐miR‐1260a, hsa‐miR‐302c‐3p, hsa‐miR‐484, hsa‐miR‐493‐3p, hsa‐miR‐514a‐3p, hsa‐miR‐592, hsa‐miR‐124‐3p, hsa‐miR‐145‐5p, hsa‐miR‐30a‐5p and hsa‐miR‐483‐5p. Hsa‐miR‐592 and hsa‐miR‐514a‐3p have not been previously related to GBM and therefore represent novel candidates for selective biomarkers. Besides, 11 viral miRNAs were found to be differentially expressed in plasma of GBM patients. Viral miRNAs allow for viral persistence in the host by inhibiting the cell‐mediated immunity, apoptosis and cell‐cycle, thereby providing conditions favouring latency. These mechanisms may link the viral infection to tumorigenesis, where similar processes are deregulated. We analysed our results using bioinformatic tools for their better interpretation. This approach enabled us to link the revealed miRNAs to specific signalling pathways and to the impaired immune responses leading to progression of disease. The GBM burden is reflected in alteration of plasma miRNA patterns, including those of viral miRNAs and represents a new potential for future clinical applications. However, additional validation of these newely proposed biomarker candidate miRNAs in a larger clinical study using independent cohort of patients is needed.