Učinki bisfenola A in njegovih analogov na imunski sistem in vitro

Štrukelj Pahović, Pia (author), Sollner Dolenc, Marija (mentor), Corsini, Emanuela (co-mentor)

Imunski sistem je fiziološki obrambni sistem, sestavljen iz skupka organov in celic, ki tujkom preprečujejo vstop v telo, poleg tega pa uničujejo tiste tujke, ki vanj vstopijo. Ena izmed najpomembnejših lastnosti imunskega sistema je sposobnost razlikovanja med lastnim in tujim, saj v nasprotnem primeru lahko pride tako do avtoimunskega odziva, kjer imunski sistem napade telesu lastne celice. Ob nepravilnem delovanju imunskega sistema lahko pride tako do nezadostnega kot tudi do pretiranega imunskega odziva. Imunski sistem lahko delimo na prirojeno (nespecifično) in pridobljeno (specifično) imunost; slednja ima tudi sposobnost tvorjenja imunskega spomina. Poleg tega lahko imunski sistem delimo tudi na celično in humoralno imunost. Prva je sestavljena iz celic imunskega sistema, druga pa iz topnih mediatorjev, kot so protitelesa in citokini. Imunski sistem je povezan tudi z endokrinim (hormonskim) sistemom. Po definiciji Svetovne zdravstvene organizacije je kemijski motilec endokrinega sistema eksogena snov ali zmes snovi, ki vpliva na delovanje endokrinega sistema in posledično povzroči škodljive učinke v organizmu, njegovih potomcih ali (sub)populacijah. Gre za strukturno raznoliko skupino kemikalij različnega izvora. Fitoestrogeni so hormonski motilci naravnega izvora, med sintetizirane hormonske motilce pa spadajo kemikalije, ki se uporabljajo v proizvodnji plastike, pesticidi, fungicidi, industrijska topila, zdravila ter izdelki za osebno nego. Ljudje smo torej dnevno izpostavljeni endokrinim motilcem preko vode, hrane, zraka ter prej omenjenih izdelkov. Bisfenol A (BPA) se uporablja v proizvodnji polikarbonatne plastike, epoksidnih smol ter različnih potrošniških izdelkov, kot so igrače, medicinska oprema, termični papir in druge vrste papirja. Polikarbonatna plastika se uporablja za izdelavo otroških stekleničk, steklenic za vodo za večkratno uporabo, plastičnega pribora ter plastičnih posodic za shranjevanje hrane, medtem ko se epoksidne smole uporabljajo na primer v pločevinkah s hrano in pijačo. Pod določenimi pogoji lahko BPA prehaja iz embalaže v hrano in pijačo, kar predstavlja največji vir izpostavljenosti. BPA je znan kemijski motilec endokrinega sistema. Prepoved uporabe zaradi zaskrbljujočih učinkov na zdravje je privedla do zamenjave s strukturno podobnimi kemikalijami – analogi bisfenola A. V proizvodnji polikarbonatne plastike in epoksi smol so ga nadomestili bisfenol AF (BPAF), bisfenol F (BPF) in bisfenol S (BPS); slednji predstavlja tudi najpogostejšo zamenjavo BPA v termičnem papirju. Potencialna toksičnost analogov bisfenola A pa je precej manj raziskana. Obstoječi podatki nakazujejo na to, da imajo njegovi analogi podoben ali večji potencial za endokrino aktivnost in torej niso varne zamenjave BPA. Pri načrtu dela magistrske naloge smo izhajali iz študije, ki je na humani monocitni celični liniji THP-1 proučevala učinek treh bisfenolov (BPA, BPAF, BPS) na izražanje RACK1 proteina. BPA in BPAF sta pri koncentraciji 10 µM znižala vse parametre, BPS pa je imel nasproten učinek in je torej pri koncentraciji 10 µM povišal preiskovane parametre. Ker je izražanje RACK1 proteina povezano s sproščanjem citokinov IL-8 in TNF-α, so za potrditev opaženih učinkov v THP-1 celični liniji z lipopolisaharidom (LPS) sprožili imunski odziv. Rezultati so pokazali, da je ista koncentracija bisfenola (10 µM) posnemala opažene učinke na izražanje RACK1 proteina. BPA in BPAF sta torej zmanjšala sproščanje preiskovanih citokinov, medtem ko je BPS povečal njihovo sproščanje. V magistrski nalogi smo proučevali in vitro učinek BPA, BPAF in BPS na imunski sistem. V prvem delu smo se torej osredotočili na to, ali imajo preiskovani bisfenoli učinek na imunski sistem tudi pri drugih koncentracijah. Za izbiro preiskovanih koncentracij smo na THP-1 celični liniji najprej izključili morebitno citotoksičnost bisfenolov. Za nadaljnje eksperimente na tej celični liniji smo določili koncentracije 0,01 µM, 0,1 µM, 1 µM in 10 µM, saj je bil BPAF pri koncentraciji 100 µM citotoksičen. THP-1 celice smo torej izpostavili različnim koncentracijam bisfenolov (0,01–10 µM) in jim z LPS sprožili imunski odziv. S pretočnim citometrom smo izmerili izražanje površinskih markerjev (CD54, CD86), s specifičnimi ELISA testi pa smo izmerili sproščanje preiskovanih citokinov (IL-8, TNF-α). Vse eksperimente smo izvedli v treh neodvisnih ponovitvah ter dobljene rezultate statistično obdelali z enostranskim ANOVA testom, ki mu je sledil še Dunnettov test. V drugem delu magistrske naloge smo preverjali, ali lahko podoben učinek bisfenolov na imunski sistem opazimo tudi na humanih enojedrnih celicah periferne krvi (PBMC). Celice smo izpostavili eni koncentraciji bisfenolov (10 µM) ter jim sprožili imunski odziv s PMA in ionomicinom. S pretočnim citometrom smo izmerili proizvedene (intracelularne) citokine, s specifičnimi ELISA testi smo pa izmerili sproščene (ekstracelularne) citokine. Ker je vsak izmed preiskovanih citokinov (IFN-γ, IL-4, IL-17) značilen za eno vrsto celic T pomagalk (Th), smo na podlagi dobljenih rezultatov lahko sklepali na diferenciacijo PBMC v Th1, Th2 in Th17. Vse eksperimente smo izvedli v šestih neodvisnih ponovitvah, in sicer tri neodvisne ponovitve za moške donorje ter tri za ženske donorje. Dobljene rezultate smo statistično obdelali s parnim t-testom, za primerjavo imunskega odziva med moškimi in ženskami pa smo uporabili neparni t-test. V celični liniji THP-1, ki smo ji z LPS sprožili imunski odziv, je BPA zmanjšal izražanje površinskega markerja CD54 ter sproščanje citokina IL-8 pri koncentraciji 10 µM, poleg tega pa je zmanjšal izražanje površinskega markerja CD86 ter sproščanje citokina TNF-α pri koncentracijah 1 µM in 10 µM. BPAF je tudi zmanjšal izražanje obeh površinskih markerjev, in sicer pri koncentracijah 0,1 µM, 1 µM in 10 µM za CD54 ter pri koncentraciji 10 µM za CD86. Čeprav učinek BPAF na sproščanje IL-8 ni bil statistično značilen, je sledil podobnemu trendu. Učinek BPAF na TNF-α pa ni bil enoznačen, saj se je sproščanje citokina povišalo pri najnižji koncentraciji (0,01 µM) ter znižalo pri koncentracijah 1 µM in 10 µM. BPS ni imel nobenega vpliva na izražanje CD54, pri koncentracijah 0,01 µM, 0,1 µM in 1 µM pa je povišal tako izražanje CD86 kot tudi sproščanje obeh citokinov. Podobno kot pri BPAF, tudi pri BPS učinek na TNF-α ni bil monoton, saj se je sproščanje citokina zmanjšalo pri najvišji koncentraciji (10 µM). V PBMC, ki smo jim s PMA/ionomicinom sprožili imunski odziv, je BPA povečal diferenciacijo v Th1 in Th17 celice, učinek na Th2 pa ni bil statistično značilen; posledično se je tudi zvišalo razmerje med Th1 in Th2 celicami (Th1/Th2). BPAF je imel učinek nasproten BPA, saj je zmanjšal diferenciacijo v Th1 in Th17, poleg tega pa se je znižalo tudi razmerje Th1/Th2. Tudi BPAF ni imel statistično pomembnega učinka na celice Th2. BPS je imel na diferenciacijo PBMC v Th podoben učinek kot BPA, saj je povečal polarizacijo v Th1, Th2 in Th17. Učinek BPS na razmerje Th1/Th2 pa je bil podoben BPAF, saj ga je tudi BPS zmanjšal. Poleg tega smo pri diferenciaciji v Th1 opazili tudi nekaj razlik med spoloma. Polarizacija v Th1 je bila v primeru BPA in BPS višja pri ženskah kot pri moških, pri BPS pa je bila pri ženskah tudi višja od kontrole. Pri BPAF nismo opazili nobenih razlik med spoloma. Na podlagi dobljenih rezultatov lahko zaključimo, da in vitro bisfenoli (BPA, BPAF, BPS) vplivajo na imunski sistem. Ker pa vsak izmed preiskovanih bisfenolov izkazuje svoje učinke na drugačen način, so potrebne dodatne študije. Na podlagi dobljenih rezultatov in pregledane literature lahko zaključimo tudi, da analogi bisfenola A niso najbolj varne alternative.

• Language: Slovenian
• Keywords: bisfenoli, kemijski motilci endokrinega sistema, THP-1 celična linija, humane enojedrne celice periferne krvi, učinki na imunski sistem
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2022
• PID: 20.500.12556/RUL-143468
• Publication date in RUL: 22.12.2022

Secondary language

• Language: English
• Title: In vitro effects of bisphenol A and its analogues on immune system

Abstract

The immune system is a physiological defense system, which prevents potentially harmful pathogens from entering the body and destroying those that enter it. When not working properly, it can result in immunodeficiency, hypersensitivity, or autoimmunity. Endocrine disrupting chemicals (EDC) are a group of chemicals from either natural or synthetic origin, which can affect both endocrine and immune system. Bisphenol A (BPA) is used in the manufacturing of polycarbonate plastics, epoxy resins, and several consumer products. As a consequence, human exposure to BPA is practically ubiquitous. Under the normal conditions of use, BPA may leach from said products. As BPA is a known endocrine disrupting chemical, there are some concerns about the health effects. Consequently, changes in regulations on both use and production of BPA were made, which have led to increase in replacing BPA with structurally similar chemicals called bisphenol. However, in comparison with BPA, bisphenol analogues are not that well researched, and their potential toxicity is poorly understood. As the endocrine and the immune system are linked, several in vitro and in vivo studies evidenced the ability of EDCs (including BPA) to modulate immune response. Due to the structural similarities, bisphenol analogues resulted in similar or greater endocrine disrupting potentials as BPA. Existing data suggests that bisphenol analogues resulted in toxic effects that were similar or greater as BPA. Thus, bisphenol analogues may not be safer BPA alternatives. However, as there is not enough data for the risk assessment of bisphenol analogues, future research is needed. The aim of this master’s thesis was to investigate in vitro immunomodulatory effects of BPA and two bisphenol analogues, namely bisphenol AF (BPAF) and bisphenol S (BPS). The first part was focused on the alteration of the lipopolysaccharide (LPS)-induced immune response in THP-1 human leukemia monocytic cell line, while the second part was focused on the alteration of phorbol 12-myristate 13-acetate and ionomycin (PMA/ionomycin)-induced T helper (Th) cell differentiation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Overall, our data indicates that BPA decreased LPS-induced expression of CD54 and the release of cytokine IL-8 at concentration 10 µM and it also induced the expression of CD86 and the release of the cytokine TNF-α at concentrations 1 and 1 µM. BPAF had a similar effect on the examined parameters as it decreased LPS-induced expression of surface markers CD54 at concentrations 0.1, 1, and 10 µM, and CD86 at concentration 10 µM. Even if IL-8 appeared to follow the same trend, the observed effects were not statistically significant. The effects on TNF-α, however, appeared to be nonmonotonic as the release was increased at concentration 0.01 µM and decreased at concentrations 1 and 10 µM. BPS had the opposite effect on the investigated parameters, thus increasing LPS-induced expression of CD86 and the release of both cytokines at concentrations 0.01, 0.1, and 1 µM. The effects on CD54 expression were not statistically significant, whereas the effect on TNF-α was also nonmonotonic as the highest concentration tested (10 µM) decreased the release. All bisphenols affected both PMA/ionomycin-induced Th cell differentiation and the release of the related cytokines. The most notable change was a shift in the Th1/Th2 ratio as, at the concentration 10 µM (only concentration tested), BPA increased it and BPAF and BPS decreased it. In addition, BPA up-regulated Th1 and Th17 polarization, while BPAF had the opposite effect, thus downregulating Th1 and Th17 polarization; neither bisphenol had any statistically significant effect on Th2 differentiation. BPS, however, upregulated the polarization of Th1, Th2, and Th17. There were also some gender-related differences regarding Th1 differentiation.

• Keywords: bisphenols, endocrine disrupting chemicals, THP-1 cell line, human peripheral blood mononuclear cells, immunomodulatory effects