Opredelitev fizioloških lastnosti ter patofiziološka vloga mehanosenzitivnih kanalov v roženičnem epitelu

Lapajne, Luka (author), Hawlina, Marko (mentor), KRIŽAJ, DAVID (comentor)

Namen: Roženični epitel je površinski roženični sloj, ki ščiti roženico pred zunanjim okoljem in je podvržen številnim mehaničnim, kemičnim, biološkim in fizikalnim dejavnikom. Nekateri izmed omenjenih dejavnikov so znani aktivatorji ali modulatorji mehanosenzitivnih kationskih kanalov, med katere prištevamo receptor prehodnega potenciala vaniloida tipa 4 (TRPV4) in Piezo1 kanale. Aktivacija mehanoreceptorjev vodi v aktivacijo znotrajceličnih poti in procesov, ki so povezani z motnjami v delovanju roženice, vnetjem, hiperalgezijo/nocicepcijo in disfunkcijo tkiva. V doktorski disertaciji smo se zato osredotočili na identifikacijo in lokalizacijo mehanosenzitivnih kationskih ionskih kanalov v celicah roženičnega epitela, ovrednotili njihov funkcionalni pomen in opredelili vlogo TRPV4 kanalov v parakrinem signaliziranju ter izločanju vnetnih in bolečinskih mediatorjev. Metode: Roženicam miši linije C57BL/6, transgene miši z izničenim genom za TRPV4 (TRPV4-/-) in transgene miši, ki smo jim gene za TRPV4 zamenjali s fluorescenčno označenimi bakterijskimi geni, ki kodirajo TRPV4 (TRPV4eGFP), smo encimsko odluščili sloj roženičnega epitela in jih uporabili za in situ poskuse. Celice roženičnega epitela, ki smo jih uporabili za in vitro poskuse, smo disociirali, nasadili na silikonske membrane ali objektna stekelca in jih gojili v inkubatorju 4–7 dni pri 37 °C. Celice roženičnega epitela smo izpostavili različnim specifičnim agonistom in antagonistom, cikličnemu vzdolžnemu mehaničnemu raztezku in ultravijoličnemu B (UVB) sevanju. S pomočjo optičnega slikanja smo ovrednotili njihov vpliv na homeostazo kalcijevih ionov (Ca2+) v različnih eksperimentalnih pogojih. Za določitev izražanja genov za izbrane proteine in njihovo lokalizacijo smo uporabili tehniki imunooznačevanja in semikvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času (qRT-PCR). Izločanje ATP iz celic roženičnega epitela po izpostavitvi različnim dražljajem smo v supernatantu kvantificirali z luciferin-luciferazno reakcijo, izločanje vnetnih molekul in citokinov pa s pomočjo kemiluminiscence. Rezultati: Celice roženičnega epitela močno izražajo TRPV4 in Piezo1 kanale. Prvi se v roženičnem epitelu pojavljajo v neenakomernem, drugi pa v bolj enakomernem vzorcu glede na sklade celic roženičnega epitela. Skladno s tem sta specifična agonista GSK101 in YODA1 povzročila povečanje koncentracije prostih znotrajceličnih kalcijevih ionov ([Ca2+]i) v celicah roženičnega epitela. Signali Ca2+ so bili zmanjšani po izpostavitvi mehanskemu hipotoničnemu stresu ob uporabi specifičnega TRPV4 antagonista (HC-06) in po izpostavitvi mehanskemu raztezku ob uporabi specifičnega Piezo1 antagonista (GsMTx4). Izpostavitev temperaturi 37 °C je v celicah roženičnega epitela vodila v od TRPV4 kanalov odvisno povečanje [Ca2+]i. Aktivaciji TRPV4 kanalov je sledilo od Ca2+ odvisno izločanje ATP, ki je bilo zavrto ob farmakološki blokadi paneksinskih hemikanalov s probenecidom. Farmakološka aktivacija proteazno aktiviranih receptorjev 2 (PAR-2) je senzibilizirala TPRV4 kanale za aktivacijo z agonistom. UVB sevanje je v celicah roženičnega epitela vodilo do reverzibilnega povečanja [Ca2+]i, učinek je bil delno zmanjšan ob farmakološki blokadi TRPV4 kanalov ali njihovi genetski odstranitvi. Povečanje [Ca2+]i ob stimulaciji z UVB sevanjem je bilo primarno posledica sprostitve Ca2+ iz znotrajceličnih rezerv, predvsem iz endoplazemskega retikuluma. Tako farmakološka aktivacija TRPV4 kanalov kot UVB sevanje sta v celicah roženičnega epitela povzročila povečano izločanje nekaterih provnetnih citokinov in vnetnih mediatorjev, ki je bilo specifično glede na dražljaj in izničeno ob farmakološki blokadi TRPV4 kanalov. Zaključki: Naši rezultati kažejo, da je pri mehanotransdukciji v celicah roženičnega epitela udeleženih več različnih mehanoreceptorjev. Eni izmed najpomembnejših mehanoreceptorjev so TRPV4 kanali, ki so aktivirani z osmotskim stresom. Preko homeostaze znotrajceličnega Ca2+ so povezani z od Ca2+ odvisnim izločanjem ATP iz celic preko paneksinskih hemikanalov in so tako vključeni v purinergično avtosignalizacijo. V celicah roženičnega epitela TRPV4 kanali niso povezani z zaznavanjem mehanskega raztezka, ki ga zaznavajo Piezo1 kanali. TRPV4 kanale aktivirata tudi povečana temperatura in UVB sevanje, senzibilizira pa jih aktivacija PAR-2 receptorjev. Na škodljivo UVB sevanje se celice roženičnega epitela odzovejo z aktivacijo TRPV4 kanalov in sprostitvijo Ca2+ iz znotrajceličnih zalog. Molekule, ki se nahajajo v solzah, lahko prispevajo k od PAR-2 receptorjev odvisni regulaciji TRPV4 kanalov in tako posredno, tudi preko TRPV4 kanalov, vplivajo na delovanje roženičnega epitela v patoloških pogojih. Na roženično okolje najverjetneje vplivajo tudi vnetne molekule, sproščene iz celic roženičnega epitela ob aktivaciji TRPV4 kanalov oziroma ob izpostavitvi UVB sevanju. Vnetne molekule imajo lahko učinek na nocicepcijo, celjenje in prozornost roženice. V splošnem ta študija opredeljuje Piezo1 kanale kot pomembne mehanoreceptorje in TRPV4 kanale kot potencialno novo tarčo pri procesih, povezanih z vnetjem očesne površine in tkivno poškodbo v celicah roženičnega epitela.

• Language: Slovenian
• Keywords: roženica, roženični epitel, mehanosenzitivni kanali, TRPV4, Piezo1, kalcij, ATP, UVB
• Work type: Doctoral dissertation
• Organization: MF - Faculty of Medicine
• Year: 2022
• PID: 20.500.12556/RUL-141747
• COBISS.SI-ID: 127365123
• Publication date in RUL: 07.10.2022

Secondary language

• Language: English
• Title: Characterization of physiological characteristics and pathophysiological role of mechanosensitive channels in corneal epithelium

Abstract

Purpose: Corneal epithelium – the outermost corneal layer that protects the cornea from the environment – is subjected to various mechanical, biological, chemical, and physical stressors. Many are known activators or modulators of mechanosensitive cation channels. Mechanoreceptors' activation can lead to downstream pathways that are linked to impaired corneal physiology, inflammation, hyperalgesia/nociception, and tissue dysfunction. We localised mechanotransducing cation permeable TRPV4 and Piezo1 ion channels to corneal epithelial cells, characterized their functional properties and assessed their functions in paracrine signalling and the release of inflammatory and nociceptive transmitters. Methods: Corneal epithelia from C57BL/6, TRPV4-/- and TRPV4eGFP mice were enzymatically detached from the stroma and used for in situ experiments. In vitro, epithelial cells were dissociated, plated onto silicon membranes or cover slips, and cultured for 4-7 days. Cells were subjected to either assorted agonists and antagonists, cyclic equiaxial mechanical stretch, or UVB radiation. Optical imaging assessed the properties of Ca2+ homeostasis under different experimental conditions. Immunolabeling and qRT-PCR were performed to determine the changes in gene and protein expression, and localization. For ATP and cytokine release assays, cells were dissociated, subjected to assorted stimuli and supernatants were evaluated by luciferin-luciferase and chemiluminescence reaction, respectively. Results: Corneal epithelial cells strongly express TRPV4 and Piezo1 channels, the former being localized in a non-uniform and the latter in a uniform pattern. Accordingly, the selective agonists GSK101 and YODA1 increased [Ca2+]i in corneal epithelial cells, whereas swelling and pressure induced Ca2+ signals were averted by the selective TRPV4 (HC-06) and Piezo1 inhibitor (GsMTx4), respectively. Heating of corneal epithelium to 37°C evoked TRPV4 dependent [Ca2+]i elevations. The epithelial cells responded to TRPV4 activation with massive release of ATP that was sensitive to the pannexin 1 blocker probenecid and showed Ca2+ dependence. Pharmacological activation of the protease-activated receptor-2 (PAR-2) sensitized TRPV4 for agonist activation. UVB radiation reversibly elevated [Ca2+]i, principally reflected release of Ca2+ from the pool stored intracellularly within the endoplasmic reticulum and was modestly attenuated by TRPV4 ablation or inhibition. UVB radiation and TRPV4 activation evoked stimulus-specific release of proinflammatory cytokines and inflammatory substances, effects that were antagonized by pharmacological blockade of TRPV4. Conclusions: We found that corneal mechanotransduction involves activation of multiple force-activated channels which regulate fundamental aspects of corneal epithelial biology. A principal mechanosensor is TRPV4, which is activated by osmotic stress and contributes to [Ca2+]i homeostasis through Ca2+-dependent release of ATP, purinergic auto-feedback and hemichannel (pannexin) activation. Interestingly, TRPV4 fails to mediate stretch-evoked Ca2+ responses, which are instead mediated by another mechanochannel, Piezo1. In addition to osmotic gradients, TRPV4 channels in the corneal epithelium are activated by moderate heat, UVB radiation and sensitized by the PAR-2 receptor. Our data suggest that corneal epithelial cells respond to harmful UVB radiation with parallel and additive activation of TRPV4 channels and release of Ca2+ from intracellular stores. It is possible that substances residing in tears contribute to PAR-2-mediated TRPV4 regulation in corneal epithelial cells under pathological conditions. In addition, the corneal milieu is likely to be influenced by TRPV4- and/or UVB-dependent release of cytokines and inflammatory substances, with potential effects on transparency, wound healing, and nociception. Overall, this study identifies Piezo1 as an important corneal epithelial mechanosensor that may be triggered by acute impact and TRPV4 as a potential target of ocular surface inflammation, UVB impact and tissue damage.

• Keywords: cornea, corneal epithelium, mechanosensitive channels, TRPV4, Piezo1, calcium, ATP, UVB