Krompir (Solanum tuberosum) je gomoljnica, ki se goji v zmernem podnebju in predstavlja eno najpomembnejših svetovnih poljščin v smislu celotne proizvodnje hrane. Rastlino krompirja napadajo številni patogeni, ki povzročajo velike izgube pridelovalcem krompirja po vsem svetu. Bakterije, glive, virusi, nematode in žuželke povzročajo resne omejitve proizvodnje. Da bi sledili povpraševanju po krompirju, moramo razumeti mehanizme, ki rastlini omogočajo, da se upre grožnjam zaradi številnih biotskih in abiotskih stresorjev.
Rastlinski imunski sistem je posledica evolucijske bitke med rastlinami in patogeni. Rastlina skuša odkriti povzročitelja in sprožiti obrambni odziv, kot je povečanje ravni reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS), medtem ko je glavni cilj patogenov, da se tem mehanizmom izognejo. Po prepoznavanju patogena raznolika hormonska signalizacija v rastlini omogoča usklajen imunski odziv. Pri tem so salicilna kislina (SA), jasmonska kislina (JA) in etilen (ET) priznani kot glavni hormoni, udeleženi v rastlinski obrambi. V prisotnosti različnih patogenov ali škodljivcev se lahko aktivirajo različne vrste sistemskih imunskih odzivov. V prisotnosti biotrofnih patogenov, torej tistih, ki so razvili načine za izkoriščanje živega gostitelja, se aktivira tako imenovana sistemska pridobljena odpornost (SAR). Pri tem odzivu ima SA ključno vlogo in vključuje izražanje genov, povezanih s patogenezo (PR). V prisotnosti nekrotrofnih patogenov, torej patogenov, ki običajno uničijo gostitelja in zaužijejo njegovo vsebino, JA aktivira inducirano sistemsko odpornost (ISR), medtem ko ET deluje sinergistično z JA. Poleg biotskega stresa se rastlina upira tudi abiotskemu stresu, kot so suša, povečana slanost tal, vročina ali mraz. Ključni fitohormon v tem odzivu je abscizinska kislina (ABA). Čeprav ti trije hormoni, SA, JA in ABA, običajno delujejo antagonistično, so nekateri geni inducirani z več hormonskimi potmi. Ostali hormoni, ki nimajo glavne vloge v stresnem odzivu, modulirajo vpliv stresnih hormonov. Tako signalizacija avksina lahko zavre ravni SA in SA signalizacijo.
Da bi časovno in prostorsko spremljali kompleksno imunsko signalizacijo rastlin, uporabljamo biosenzorje. Biosenzorji so naprave, ki uporabljajo biološke zaznavne elemente za ustvarjanje merljivega odziva. Glede na mehanizem delovanja lahko biosenzorje razvrstimo v neposredne, običajno reverzibilne, ki delujejo neodvisno od celičnega okolja in posredne, imenovane tudi reporterje, ki so običajno nepovratni in odvisni od dodatnih celičnih komponent. Posredni biosenzorji so običajno transkripcijski reporterji, sestavljeni iz promotorja, ki vsebuje cis-regulatorne elemente, ki se odzivajo na analit, in reporterskega gena, kot je beta-glukuronidaza (GUS), fluorescenčni protein (FP) ali luciferaza. Poleg vezavnega mesta za prediniciacijski kompleks, ki je nujen za začetek transkripcije, med cis-regulatorne elemente spadajo številna mesta za vezavo transkripcijskih faktorjev (TF). TF omogočijo specifično izražanje gena v določenem tkivu ali situaciji.
V naših eksperimentih smo promotor sklopili z zapisom za luciferazo kresnice. Ta bioluminiscenčni protein katalizira oksidativno dekarboksilacijo substrata D-luciferina v oksiluciferin, pri tem pa oddaja svetlobo. Pod pravimi pogoji je količina oddane svetlobe linearno sorazmerna s koncentracijo luciferaze. Luciferaza ima številne prednosti pred ostalimi reporterji, ker omogoča visoko občutljivost, možnost in vivo spremljanja in odda signal, ki je časovno odvisen od izražanja gena. Največja pomanjkljivost sistema je, da eksogeni luciferin ne prodre zlahka skozi rastlinsko tkivo, zaradi česar lahko nastanejo težave pri meritvi.
Cilj magistrskega dela je bil analizirati funkcionalnost promotorja gena PTI5 in da preverimo, če je primeren kandidat za biosenzor imunskega odziva krompirja. PTI5 je transkripcijski faktor iz poddružine ERF, za katerega se je izkazalo, da se mu poveča izražanje med napadom biotrofov, zaradi česar smo pričakovali najmočnejši odziv pri tretiranju s SA. Iz doktorske disertacije Tjaše Lukan smo že imeli na voljo zapis za promotor PTI5 in predvidena vezavna mesta za TF na njem. Z analizo teh vezavnih mest smo ugotovili, da številni fitohormoni mogoče vplivajo na izražanje gena. Poleg najštevilčnejšnih vezavnih mest za SA-odzivne TF so prisotna tudi vezavna mesta, ki se odzivajo na druge stresne hormone. Zanimivo je, da se dobršen del SA-odzivnih vezavnih mest odziva tudi na avksine, ki pogosto nasprotujejo signalizaciji SA. Zaradi tega smo analizirali odziv promotorja PTI5 na SA, JA, ABA in avksine.
Različico R1 promotorja PTI5 smo pomnožili in zaporedje vstavili v vector pENTR/D-TOPO. Insert smo nato prenesli v ekspresijski plazmid preko Gateway LR-reakcije. Ko smo pripravili ekspresijski plazmid pGWB435-PTI5, smo plazmid izolirali iz E. coli in ga vnesli v Agrobacterium tumefaciens, ki smo jih uporabili za prehodno transformacijo (agroinfiltracijo) rastlin Nicotiana benthamiana in Solanum tuberosum. Transformirane rastline smo uporabili za analizo aktivnosti promotorja PTI5 v prisotnosti različnih hormonov ali po inokulaciji s krompirjevim virusom Y (PVY). Analizo smo izvedli z luciferaznim testom aktivnosti promotorjev.
Luciferazni test se izvaja po protokolu, ki so ga optimizirali na Nacionalnem Inštitutu za Biologijo (NIB) za naše potrebe. Liste rastlin smo prehodno agroinfiltrirali tri do štiri dni pred eksperimentom. Listne diske smo vzorčili v parih, tako da smo eksperimente lahko zanesljivo primerjali med seboj, in jih polagali na hranilno raztopino z luciferinom v ploščo z 96 vdolbinicami, kjer smo jih tretirali z hormoni. Ploščo z vzorci smo dali v luminometer, s katerim smo dobili signale, ki smo jih uporabljali za statistično analizo rezultatov v Excelu. Tretirali smo s šestimi različnimi koncentracijami vsakega hormona v razponu, ki je pokazal zanimive rezultate v literaturi, pri čemer smo dodali še netretirano kontrolo. Hormon smo v hranilno raztopino dodali po treh do štirih urah inkubacije v njej, s čimer smo se znebili predhodno nakopičene luciferaze, do česar je prišlo zaradi aktivnosti promotorja pred testiranjem s hormoni. Rezultate smo prikazali na dveh grafih, z grafom aktivnosti promotorja vseh vzorcev in grafom povprečne aktivnosti promotorja, ki je vseboval še rezultate t-testa, s katerim smo določili, če je razlika med kontrolo in tretmajem statistično pomembna. Luciferazni test se je, kot pri prejšnjih raziskavah, izkazal kot zanesljiva metoda pri delu z rastlino N. benthamiana.
Najbolj zanimivi rezultati so nastali pri tretiranju s SA, pri čemer so srednje in visoke koncentracije povzročile močno indukcijo izražanja reporterja. Ker ima celica različen odgovor v odvisnosti od koncentracije SA, predpostavljamo, da je gen PTI5 vpleten v procese med preobčutljivostnim odgovorom, ki povzroča celično smrt in omejevanje širitve patogena. Tretiranje z JA in ABA je povzročilo indukcijo izražanja šele pri nenavadno visokih koncentracijah. Možno je, da JA in ABA ne inducirata ekspresije PTI5 neposredno preko svoje signalne poti, ampak da toksičnost visokih odmerkov teh dveh hormonov ali prepletenost njunih signalnih poti in SA povzroči povečanje izražanja gena. Obstaja tudi možnost, da je PTI5 manj občutljiv na ta dva hormona kot drugi geni, zaradi česar pride do spremembe signala šele pri večjih koncentracijah. To bi lahko preverili z istočasnim tretiranjem vzorca z JA ali ABA s SA. Z analizo rezultatov vpliva avksinov smo ugotovili, da ta hormon povzroči represijo PTI5. Represijo smo opazili samo pri eni koncentraciji, vendar smo ob pregledu literature ugotovili, da so se avksin odzivni geni podobno odzvali tudi v že objavljenih eksperimentih. Takšni rezultati so bili tudi pričakovani, saj je znano, da avksini med stresom nasprotujejo signalizaciji s SA. Na splošno ti rezultati kažejo, da bi lahko promotor PTI5 uporabili kot specifičen biosenzor visoke koncentracije SA v rastlinah - če bi zbrali več podatkov, ki potrjujejo našo hipotezo.
Da bi ugotovili pravo naravo izražanja PTI5 med stresom, smo poskuse ponovili na krompirju. Glavni cilj teh poskusov je bil preveriti, ali genotipa Desiree in Rywal s transgenom NahG lahko uporabimo kot eksperimentalna gostitelja v poskusih luciferazega testa. NahG, transgen, ki kodira encim salicilat hidroksilazo, naredi rastlino bolj občutljivo na biotrofne patogene, kot je A. tumefaciens. Torej pričakujemo, da bo z agrobakterijami posredovana prehodna transformacija bolj učinkovita kot pri divjem tipu rastlin. Ker je pri N. benthamiana prišlo do najizrazitejšega odziva pri tretiranju s SA in avksinom, smo rezultate najprej ponovili s tema dvema hormonoma na prehodno transformiranih rastlinah Desiree NahG. Ugotovili smo, da je luminiscenca pri teh vzorcih bistveno nižja v primerjavi z rezultati iz poskusov z N. benthamiana. To je verjetno posledica nižje učinkovitosti prehodne transformacije. Ob tem smo ugotovili, da ni jasne podobnosti z rezultati poskusov z N. benthamiana, za kar je mogoče odgovorna slabša difuzija hormonov v tkivo. Na koncu smo želeli preveriti še, kako na aktivnost promotorja PTI5 vpliva okužba s krompirjevim virusom Y (PVY) pri rastlinah Rywal NahG. Ta poskus bi nam pokazal, če je indukcija PTI5 pri okužbi z biotrofi odvisna od SA. Tudi v tem primeru nismo mogli ugotoviti pričakovane indukcije promotorja, saj razlika med okuženim vzorcem in neokuženim ni bila statistično pomembna. Čeprav so bili poskusi z N. benthamiana uspešni, se luciferazni test s S. tuberosum ni izkazal kot zanesljiva alternativa.
|
