Vanadijevi(V) okso kompleksi s salanom in njihova sposobnost cepitve DNA

Zorman, Maša (author), Bratkovič, Tomaž (mentor), Sissi, Claudia (comentor)

Rak je ena izmed vodilnih bolezni, ki prispevajo k prezgodnji smrti. Samo v letu 2020 je zaradi raka umrlo skoraj 10 milijonov ljudi. Med različnimi načini zdravljenja raka še vedno prevladujeta kemoterapija in radioterapija. Cilj kemoterapije je ustavitev rasti in razmnoževanja tumorskih celic, kar je mogoče zaradi interakcij kemoterapevtikov z različnimi makromolekularnimi tarčami in poseganjem v kritične celične funkcije, kot sta npr. sinteza proteinov in replikacija DNA. Glavni problem kemoterapevtikov je obilica neželenih učinkov kot posledica njihovega delovanja. Odkritje cisplatina v 60-ih letih preteklega stoletja predstavlja velik mejnik v zgodovini kemoterapevtikov na osnovi kovin in je razlog, da se še vedno vlaga v raziskovanje kovinskih kompleksov kot potencialnih terapevtskih sredstev. Kljub široki uporabi cisplatina in njegovih derivatov kot kemoterapevtikov so z uporabo Pt(II)-kompleksov povezane številne omejitve. Različne vrste toksičnosti, izredno močni neželeni učinki in razvoj odpornosti proti zdravilni učinkovini so spodbudili raziskave in razvoj na področju pacientu prijaznejših protirakavih terapij. Različne vanadijeve spojine dokazano motijo biološke funkcije številnih celičnih tarč in obetajo kot potencialne protirakave učinkovine. V nedavni raziskavi vanadijevih(V) okso kompleksov s salanom so dokazali primerljivo, pogosto tudi višjo, aktivnost kompleksov pri zaviranju tumorskih celic v primerjavi s cisplatinom. Zaradi obetavnosti vanadijevih(V) okso kompleksov s salanom kot potencialnih protirakavih sredstev smo se v magistrskem delu odločili sintetizirati vrsto kompleksov ter raziskati njihovo stabilnost in sposobnost cepitve DNA. V magistrski nalogi smo pripravili pet različnih vanadijevih(V) okso kompleksov s salanom in testirali njihovo aktivnost v in vitro-testu s plazmidom pBR322. Pri biološkem testiranju smo komplekse inkubirali s plazmidom in opazovali vpliv naraščajoče koncentracije kompleksov na njihovo sposobnost cepitve DNA. Agarozna gelska elektroforeza je omogočila ločitev nadzvite oblike DNA od cepljene oblike (tj. z zarezo v eni od komplementarnih verig), na podlagi česar smo lahko izvedli kvantifikacijo cepljene DNA pri različnih koncentracijah kompleksa. Opazili smo, da s povišanjem koncentracije kompleksa v inkubacijski mešanici ni signifikantnega porasta v količini cepljene DNA. Zato smo se odločili, da preučimo, kaj se dogaja v inkubacijski mešanici. S kombinacijo analiznih tehnik, kot so jedrska magnetna resonanca, masna spektrometrija in UV-Vis-spektrometrija, smo raziskali stabilnost kompleksov v inkubacijskih pogojih. Opazili smo, da so kompleksi podvrženi hitri disociaciji v eksperimentalnih pogojih med inkubacijo s pBR322. Z izvedbo kinetičnih študij in titracij kompleksov v različnih razmerjih dimetilsulfoksida in fosfatnega pufra smo potrdili, da prisotnost vode v inkubacijski mešanici privede do dekompleksacije. Masna spektrometrija je omogočila, da smo potrdili identiteto novonastalih spojin. Izkazalo se je, da voda privede do hidrolize kompleksa, zato masni spektri vzorcev, ki so vsebovali vodo, prikazujejo dominanten vrh pri m/z (razmerje med maso in nabojem), ki ustreza m/z prostega liganda. Kompleksi ostanejo stabilni samo v čistem dimetilsulfoksidu, kjer nismo opazil nikakršne spremembe UV-Vis-spektra in 51V-NMR-spektra po inkubaciji, masni spekter pa vsebuje poglavitni vrh, ki se ujema z m/z kompleksa. Želeli smo preizkusiti tudi vpliv zamenjave topila na stabilnost kompleksov. Ugotovili smo, da so kompleksi prav tako nestabilni v čistem acetonitrilu in mešanici acetonitrila z vodo. Produkt nestabilnosti, ki nastane v primeru inkubacije kompleksa v acetonitrilu, je sodeč po UV-Vis-spektru najverjetneje drugačen od liganda, ki nastane zaradi hidrolize kompleksa v mešanici dimetilsulfoksida in vode. Verjetno v acetonitrilu poteče bodisi oksidacija kompleksa bodisi dimerizacija kompleksa, žal pa zaradi tehničnih težav ni bilo mogoče izvesti analize z masno spektrometrijo. Preizkusili smo tudi analogni pentakoordinirani vanadijev(V) okso kompleks in ugotovili, da je nestabilen v kakršnikoli mešanici dimetilsulfoksida in pufra, vendar popolnoma stabilen v acetonitrilu in acetonitrilu z dodano vodo. Izvedba agarozne gelske elektroforeze z novim kompleksom pa je žal potrdila, da tudi tu ni nikakršne povezave med koncentracijo kompleksa in sposobnostjo cepitve DNA. Ker so kompleksi občutljivi na vodo, smo se odločili poskusiti vgraditi določene komplekse v micele, ki bi komplekse lahko zaščitili pred vodnim okoljem in preprečili njihovo hidrolizo ter omogočili podaljšano delovanje kompleksov. Vgradnja pentakoordiniranega kompleksa v tri različne vrste micelov je bila uspešna, kljub temu pa inkubacija s plazmidom in agarozna gelska elektroforeza nista razkrili nič obetavnega. Problem je najverjetneje nezmožnost kompleksov, da se sprostijo iz micelov in so zato popolnoma neaktivni. Nazadnje smo se odločili izvesti še titracijo kompleksov s telečjo timusno DNA, s čimer smo potrdili, da prihaja do interakcij med DNA in kompleksi, le da interakcija verjetno ne vodi v cepitev DNA, temveč verjetno lahko citotoksičnost pripišemo drugačnemu mehanizmu delovanja. Najverjetneje prihaja do vezave kompleksov na DNA, kar bi lahko potencialno vodilo v zaustavitev esencialnih celičnih mehanizmov, kot so npr. podvojevane DNA in prepisovanje iz DNA v mRNA. Izračunali smo tudi navidezno konstanto disociacije za interakcije med DNA in posameznim kompleksom. Vrednosti konstante disociacije so bile v razponu med 3 μM in 30 μM, kar ne nakazuje na pretirano močno interakcijo med DNA in kompleksi, lahko pa vendarle vsaj deloma pojasni citotoksičnost, ki so jo opazili v predhodnih študijah na tumornih celičnih linijah. To delo je omogočilo majhen vpogled v aktivnost in mehanizem vanadijevih(V) okso kompleksov s salanom. Zagotovo kompleksi interagirajo z DNA in se nanjo vežejo, kar lahko pojasni opažanja predhodnih raziskav. Nikakor pa ne moremo izključiti možnosti, da kompleksi delujejo še na kakšno drugo celično tarčo. Preden lahko z gotovostjo trdimo, kakšen je mehanizem delovanja kompleksov, pa so zagotovo potrebne nadaljnje raziskave.

• Language: Slovenian
• Keywords: kemoterapija, kemoterapevtiki, vanadij(V) okso kompleksi, vanadijevi kompleksi s salanom
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2021
• PID: 20.500.12556/RUL-137870
• Publication date in RUL: 04.07.2022

Secondary language

• Language: English
• Title: Vanadium(V) oxo complexes with salan ligands and their DNA cleavage properties

Abstract

The discovery of cisplatin sparked an immense interest in the research of metal complexes as potential therapeutic agents in cancer therapy. Due to many therapeutic limitations associated with cisplatin, the search for patient-friendlier cancer therapies is now taking place. Vanadium compounds have been found to interact with different molecular targets and show potential as chemotherapeutic agents. Recently, a series of vanadium(V) oxo complexes with salan ligands exhibited a comparable, often even higher, activity to cisplatin. We prepared five different vanadium(V) oxo complexes with salan ligands and tested them in an agarose gel electrophoresis in vitro assay with pBR322 DNA plasmid in order to determine their DNA cleavage activity. Using four different concentrations of the complexes, we found no significant increase of DNA cleavage as the concentration of the complexes increased. Using a combination of analytical techniques, we noted that the complexes undergo rapid dissociation under the experimental conditions used during the incubation with the plasmid. In a series of kinetic studies and titrations with the complexes in different ratios of DMSO and phosphate buffer, we established that the presence of water causes the decomplexation. We also tested an analogous pentacoordinate oxovanadium(V) complex that was even less stable. Switching the solvent from DMSO/buffer to acetonitrile/water proved to stabilize the pentacoordinate oxovanadium(V) complex, but not the VO-salan complexes. In attempt to protect the complexes from the aqueous environment, we incorporated some of them into micelles. After a successful incorporation, we performed another electrophoresis experiment that revealed, that there is no DNA nicking. Finally, we decided to perform a titration experiment with calf thymus DNA and our complexes, that showed that there is indeed an interaction between the complexes and the DNA. This indicates that DNA is likely a target for the complexes, but DNA cleavage is just not the mechanism of their cytotoxicity. This piece of work managed to provide a small glimpse into the action of VO-salan complexes. We have confirmed that the complexes bind to the DNA, which can explain the cytotoxicity that was noted in previous studies. Yet, we cannot exclude other possible cellular targets with which the complexes may interact.

• Keywords: chemotherapy, chemotherapeutic agents, vanadium(V) oxo complexes, vanadium salan complexes