Vpliv primarne in sekundarne hipertenzije pri podganah na moč kontrakcije srčne mišice

Kobentar, Zala (author), Lunder, Mojca (mentor), Pędzińska-Betiuk, Anna (comentor)

Hipertenzija je definirana kot povišan krvni tlak in vodi v srčno-žilne zaplete kot so hipertenzivna bolezen srca, srčno popuščanje, ishemična bolezen srca, srčni infarkt in kronična ledvična bolezen, ki so vzrok za več kot polovico smrti v svetovni populaciji. Glede na izvor hipertenzijo delimo na primarno in sekundarno. Vzrok mnogo pogostejše primarne hipertenzije je neznan. Najverjetneje ima največji vpliv kombinacija genetske predispozicije z okoljskimi dejavniki. Sekundarna hipertenzija nastane zaradi ledvičnih, nevrogenih, srčno-žilnih in hormonskih vzrokov, obstrukcije zgornjih dihalnih poti ter hiperaldosteronizma. Predklinične študije so nepogrešljiv korak v procesu razvoja novih zdravilnih učinkovin, v katerih med drugim preučujemo farmakodinamiko v in-vitro ter in-vivo okoljih, katerih del so tudi poskusi na živalih. Pri farmakodinamiki vrednotimo razmerje med koncentracijo učinkovine in njenim biološkim učinkom, z dodatnim določevanjem potentnosti, varnosti in terapevtskega indeksa. Del predkliničnih študij zajema tudi poskuse na živalih, najpogosteje na glodalcih. Ti poskusi temeljijo na načelu 3R (replacement, reduction, refinement). Za namen magistrske naloge smo izvedli poskuse, s katerimi smo ovrednotili, kako različni podganji modeli hipertenzije vplivajo na učinek neselektivnega kanabinoidnega agonista (CP55940) in neselektivnega adrenergičnega agonista (izoprenalin) na moč kontrakcije izoliranega levega atrija. Želeli smo ugotoviti kateri modeli hipertenzije so najprimernejši za prihodnje eksperimente na tem področju. Pri poskusih smo uporabili tri pare podganjih modelov hipertenzije (podgane SHR, DOCA-salt 4 tedni in DOCA-salt 6 tednov) in njihove pripadajoče normotenzivne kontrolne modele (podgane Wistar-Kyoto, SHAM 4 tedni in SHAM 6 tednov). Primerjali smo fiziološke parametre in izvedli funkcionalne eksperimente na izoliranih levih atrijih podganjih srčnih mišic ob kumulativnem dodajanju naraščajočih koncentracij CP55940 in izoprenalina. Moč krčenja atrijev pri hipertenzivnih podganah smo primerjali z normotenzivnimi kontrolnimi podganami. Ovrednotili smo tudi vpliv staranja na kontaktilnost srčne mišice pri različnih normotenzivnih podganah SHAM. Podganji modeli hipertenzije se razlikujejo glede na dejavnike tveganja, ki jih nadziramo. Spontano hipertenzine podgane (SHR) so genetski model, vzgojen s parjenjem Wistar-Kyoto podgan z genetsko povišanim krvnim tlakom. So najbolje raziskan model primarne hipertenzije. Za naše eksperimentalno delo smo enako stare samce podgan SHR in kontrolne normotenzivne samce podgan Wistar-Kyoto pridobili iz Centra za eksperimentalno medicine Univerze v Białystoku. Podgane deoksikortikosteron acetat-sol (DOCA-salt) so model sekundarne hipertenzije, ki posnemajo s soljo bogato prehrano pri ljudeh. DOCA-salt hipertenzijo smo inducirali pri enako starih samcih podgan Wistar z desnostransko uninefrektomijo, subkutanim injiciranjem DOCA soli dvakrat tedensko 4 tedne ali 6 tednov ter zamenjavo pitne vode z 1% raztopino NaCl. Kontrolne normotenzivne podgane SHAM smo pridobili z lažno operacijo enako starih samcev podgan Wistar, 4 ali 6 tedenskim subkutanim injiciranjem placebo in ohranitvijo pitne vode. Vse živali vključene v eksperimente smo najprej stehtali in jim izmerili sistolični krvni tlak ter srčni utrip. Ugotovili smo, da je teža pri vseh skupinah hipertenzivnih podgan nižja v primerjavi s pripadajočimi kontrolnimi skupinami. Za merjenje krvnega tlaka pri podganah uporabljamo invazivne (neposredne) ali neinvazive (posredne) narave. Princip posrednega merjenja je podoben merjenju krvenga tlaka pri ljudeh. Aparat namestimo na podganji rep, sledi stiskanje in zaustavitev krvnega pretoka v repni arteriji ter popuščanje in zaznava sistoličnega krvnega tlaka. Pri tej metodi operacija ni potreba, so pa živali bolj izpostavljenje stresu ob merjenju. Metoda je manj natančna od invazivnega merjenja z operativno vstavljenimi pretvorniki, a je priporočljiva za ponavljajoče meritve pri bolj množičnih skupinah. Pred izvajanjem meritev smo podgane nekaj dni navajali na aparaturo in postopek z namenom, da bi med dejanskim merjenjem ostale mirne, kar bi nam zagotovilo bolj relevantne podatke o krvnem tlaku. Po aklimatizaciji na grelni ploščadi smo repno manšeto in sensor namestili na rep ter izvedli meritev. Postopek smo izvedli trikrat za vsako žival, sočasno pa odčitali tudi srčni utrip. Največja razlika v krvnem tlaku je bila zaznana pri podganah SHR glede na podgane Wistar-Kyoto. Najvišji tlak smo izmerili pri podganah DOCA-salt 6 tednov. Opazili smo tudi vpliv staranja na višanje krvnega tlaka pri podganah SHAM. Hipertenziva bolezen srca se kaže kot hipertrofična sprememba levega ventrikla, levega atrija in koronarnih arterij. Te spremembe so v osnovi kompenzatorni mehanizmi, ki srce ohranjajo v delujočem stanju, a sčasoma privedejo do nepovratnega poslabšanja. V naslednjem koraku smo anastezirane podgane žrtvovali in jim smo izrezali srčno mišico, katero smo stehtali v celoti, nato pa izrezali ter stehtali še levi in desni ventrikel. Izračunali smo parametre hipertrofije in ugotovili, da je teža celotne srčne mišice in tudi levega ventrikla povečana pri vseh hipertenzivnih podganah. Le pri podganah DOCA-salt 6 tednov smo opazili tudi desno ventrikularno hipertrofijo. Izoliran levi atrij smo namestili na aparaturo za izvajanje funkcionalnih eksperimentov. Tkivo je bilo nataknjeno na kaveljček in potopljeno v stekleno posodico s Krebsovo raztopino pri fiziološkem pH in temperature, s stalnim dovajanjem ustrezno oksigeniranega plina. Z elektrodami smo stimulirali atrij in preko računalnika odčitavali moč kontrakcij. Srce je močno oživčen organ. Srčni utrip in moč kontrakcij regulira adrenergični živčni sistem predvsem preko β1-adrenoreceptorjev. Hipertenzija je stanje prekomerne aktivacije simpatika, kar vodi v desenzitizacijo in zmanjšanje števila teh receptorjev. Njihova zavora je osnova delovanja antihipertenzivnih zdravil β-blokerjev. Na drugi strani se zaradi naraščajočega zanimanja za kanabis in njegove derivate v medicinskem zdravljenju, samozdravljenju, kozmetični in živilski industriji v zadnjem desetletju veliko raziskav usmerja v krvno-žilni endokanabinoidni sistem. Poleg negativnega inotropnega in vazodilatatornega učinka preko CB1 receptorjev, nekateri kannabinoidni agonisti (npr. kanabidiol) nakazujejo tudi na kadrioprotektivne učinke in zniževanje krvenga tlaka. Po vzpostavitvi ustrezne frekvence in moči kontrakcij atrija smo kumulativno dodajali CP55940. Učinkovino smo nato sprali, vzpostavili ustrezno kontraktilnost in kumulativno dodajali še izoprenalin. Kot pričakovano, so se vsi levi atriji na dodajanje izporenalina odzvali s povečanjem moči kontrakcij. Pri hipertenzivnih podganah SHR je bilo povečanje manj izrazito kot pri kontrolni skupini, zaradi desenzibilizacije receptorjev. Rezultati nakazujejo na zmanjšan odziv atrija na izoprenalin pri staranju. Odziv pri podganah DOCA-salt je bil kompleksnejši, saj verjetno zaradi hitre in intenzivne indukcije hipertenzije ne pride do večjih sprememb v receptorjih. Levi atriji vseh preizkušenih podgan so na dodajanje kanabinoidnega agonista odgovorili z zmanjšanjem moči kontrakcij, ki pa je bilo manj izrazito pri hipertenzivnih skupinah. Prav tako so starejše normotenzivne podgane manj občutljive na CP55940 kot mlajše, saj gostota in odzivnost CB receptorjev s staranjem upada. Eksperimenti so nas pripeljali do naslednjih zaključkov: (1) tako primarna kot tudi sekundarna hipertenzija vplivata na odziv srčne mišice po adrenergični in kanabinergični stimuaciji, (2) najbolj signifikantno razliko v odzivu na izoprenalin je bilo opaziti pri podganah SHR v primerjavi s kontrolnimi podganami Wistar-Kyoto, (3) posledica podaljšanja indukcije DOCA-salt iz 4 tednov na 6 tednov je bila zmanjšanje razlike v stimulacijskem odgovoru srca na izoprenalin, ko smo oba modela DOCA-salt primerjali s pripadajočima normotenzivnima kontrolnima skupinama, (4) posledica podaljšanja indukcije DOCA-salt iz 4 tednov na 6 tednov je bila zmanjšanje negativnega inotropnega odgovora na CP55940 v primerjavi z normotenzivnima kontrolnima skupinama, (5) staranje normotenzivnih podgan SHAM je povezano z zmanjšanjem inotropnega odgovora na izoprenalin in CP55940. Na osnovi teh opazovanj in zaključkov smo predlagali, da se podganji model primarne hipertenzije (SHR) bolj izrazito odziva na spremembe v adrenergičnih in kanabinergičnih receptorjih kot podganji model sekundarne hipertenzije. Predlagali smo tudi večjo uporabnost podgan DOCA-salt 4 tedni za nadaljno raziskovanje tako adrenergičnega kot tudi kanabinergičnega sistema v srčni mišici pri sekundarni hipertenziji.

• Language: Slovenian
• Keywords: SHR podgane, DOCA-salt podgane, hipertenzija, izoliran podganji levi atrij, kontraktilnost
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2022
• PID: 20.500.12556/RUL-135415
• Publication date in RUL: 12.03.2022

Secondary language

• Language: English
• Title: Influence of primary and secondary rat hypertension on cardiac muscle contraction force

Abstract

Hypertension is one of the main causes of various cardiovascular diseases causing more than half of all deaths worldwide. It is divided into primary and secondary hypertension. Experimental animal models are used to evaluate new options of treatment. Spontaneously hypertensive rats (SHR) are resembling primary hypertension. DOCA-salt model is reflecting secondary type of hypertension by imitation of salt-rich diet. The most recognizable attribute of hypertensive heart is an altered response to adrenergic stimulation as a consequence of receptor desensitization, leading to contractile dysfunction and heart failure. Popularity of cannabis and its derivates is growing which makes it neccessary to investigate the cardiac response on cannabinoid stimulation in hypertensive conditions. The aim of this study was to evaulate how different hypertensive rat models influence the effect of non-selective cannabinoid agonist (CP55940) and non-selective adrenergic agonist (isoprenaline) on the force of contraction of left isolated atria. The goal was to find out which models are the best for future experiments in this scientific field. Three different hypertensive models (SHR, DOCA-salt 4 weeks, DOCA-salt 6 weeks) and their normotensive control models (Wistar-Kyoto, SHAM 4 weeks, SHAM 6 weeks) were used. Firstly, physiological parameters of rats were measured. The weight of all hypertensive models was reduced compared to their normotensive controls. The non-invasive tail-cuff method was used to measure systolic blood pressure (SBP) in conscious rats. Later on, rats were sacrified and left atrium was isolated. The force of contraction was measured under the exposure of increasing concentration of CP55940 and isoprenaline. Both, primary and secondary hypertension affect atrial response for adrenergic and cannabinergic stimulation. The most significant difference in response for isoprenaline was observed in atria isolated from SHR rats in comparison to its normotensive control. Prolongation of DOCA-salt model induction from 4 to 6 weeks resulted in lack of difference in cardiostimulatory response for isoprenaline as well as in attenuation of negative inotropic response to CP55940 in comparison with normotensive control. In normotension, aging of SHAM rats showed an attenuation of inotropic response to ISO and CP55940. Based on those observations we suggest that SHR model is more prone to changes of adrenergic and cannabinoid receptors than secondary hypertension models. Four weeks of DOCA-salt treatment is suggested to be more useful for further studies evaluating both adrenergic and cannabinergic cardiac systems of secondary hypertension.

• Keywords: SHR, DOCA-salt, hypertension, isolated rat left atria, contractility