Priprava plazmidnih vektorjev za izbitje in prekomerno izražanje gena FUBP3

Srpčič, Anja (avtor), Pečar Fonović, Urša (mentor), Lovšin, Marija Nika (komentor)

V vsegenomskih asociacijskih študijah (GWAS) so do sedaj odkrili že več kot 150 genskih lokusov, povezanih z mineralno kostno gostoto. Ti genski lokusi predstavljajo potencialne označevalce za zgodnje odkrivanje osteoporoze ali pa potencialne nove tarče za zdravljenje. Eden izmed novo odkritih lokusov je enonukleotidni polimorfizem rs7851693 v intronu gena za FUBP3 (“Far upstream binding protein 3”). O vlogi proteina FUBP3 pri metabolizmu kosti ni še nič znanega. Zato smo v okviru magistrske naloge pripravili plazmidna konstrukta, s katerima bo v nadaljnjih študijah funkcijske genomike mogoče ovrednotiti vpliv spremenjenega izražanja gena FUBP3 na celične procese. Z metodo molekulskega kloniranja po Gibsonu smo sestavili plazmidni konstrukt za povečano izražanje gena FUBP3 (pFLAG-CMV-1-FUBP3) ter plazmidni konstrukt za izbitje gena FUBP3 s sistemom CRISPR/Cas9 (pX459-gRNA1-FUBP3). Za transfekcijo smo izbrali celični liniji HEK 293T, ki izvira iz človeških embrionalnih ledvičnih celic, in A549, ki izvira iz epitelijskih celic pljučnega adenokarcinoma. Po transfekciji konstrukta pFLAG-CMV-1-FUBP v celično linijo HEK 293T smo z metodo prenosa po westernu dokazali, da se izražanje proteina v celici poveča, kar kaže na uspešno pripravljen konstrukt. Spremembo, ki jo je v genomu celic HEK 293T povzročil vstavljeni vektor pX459-gRNA1-FUBP3 (metoda CRISPR/Cas9), smo ovrednotili z določitvijo nukleotidnega zaporedja tarčnega odseka genoma. Z metodo indirektne imunofluorescence smo določili lokalizacijo proteina v celicah. V celični liniji A549 se protein nahaja pretežno v citoplazmi. S plazmidnima konstruktoma, ki smo ju pripravili, smo postavili temelje za izvedbo različnih funkcijskih študij, na podlagi katerih bomo lahko lažje opredelili funkcijo gena FUBP3 in posledice njegove porušene regulacije.

• Jezik: Slovenski jezik
• Ključne besede: FUBP3, osteoporoza, molekulsko kloniranje, CRISPR/Cas9
• Vrsta gradiva: Magistrsko delo/naloga
• Organizacija: FFA - Fakulteta za farmacijo
• Leto izida: 2021
• PID: 20.500.12556/RUL-133772
• Datum objave v RUL: 15.12.2021

Sekundarni jezik

• Jezik: Angleški jezik
• Naslov: Preparation of plasmid vectors for overexpressing and knockout of the FUBP3 gene

Izvleček

So far, more than 150 genetic loci associated with bone mineral density have been discovered by genome-wide association studies (GWAS). These genetic loci represent potential biomarkers for early detection of osteoporosis or potential new therapeutic targets for osteoporosis. One of the newly discovered loci, rs7851693, is a single nucleotide polymorphism in the intron of the gene for FUBP3 (“Far upstream binding protein 3”). The roles of FUBP3 in bone metabolism are not yet fully understood. To establish a groundwork for functional genomics experiments, which could potentially help to determine the role of FUBP3 dysregulation, we prepared two plasmid constructs. We used Gibson cloning to assemble a plasmid for FUBP3 overexpression (pFLAG-CMV-1-FUBP3) and FUBP3 knockout by CRISPR/Cas9 (pX459-gRNA1-FUBP3). Two cell lines were transfected with the plasmids – HEK 293T, derived from human embryonic kidney cells, and A549, derived from lung cancer cells. Western blotting was used to confirm the changes in FUBP3 expression in the HEK 293T cell line after transfection. Sequencing was used to determine the nucleotide sequence of the gene in the HEK 293T cell line, which was subject to change after genome editing with the CRISPR/Cas9 system. Finally, indirect immunofluorescence was used to show the localization of the FUBP3 protein in the cell. In the A549 cell line, FUBP3 is localized predominantly in the cytoplasm. The two assembled plasmid constructs are a basis for further functional assays that will potentially help us understand the role of FUBP3 and its dysregulation.

• Ključne besede: FUBP3, osteoporosis, molecular cloning, CRISPR/Cas9