Molekulske interakcije med glavnim bazičnim proteinom eozinofilcev in DNA

Lavrenčič, Maruša (author), Mlinarič-Raščan, Irena (mentor), Simon, Hans - Uwe (co-mentor)

Eozinofilni granulociti so ena od podskupin levkocitov in so del prirojenega imunskega sistema. Običajno je povišano število eozinofilcev povezano z alergijskimi reakcijami in boleznimi (npr. astmo) ter z okužbami s paraziti. Med drugim imajo pomembno vlogo tudi v boju z bakterijami in virusi ter pri ohranjanju homeostaze tkiv, eozinofilijo pa opisujejo tudi pri patofizioloških procesih, kot so novotvorbe in tromboza. Po novejših odkritjih so eozinofilci vpleteni v spodbujanje imunskega odziva, prav tako pa sodelujejo pri tvorbi protiteles in regulaciji maščobnega tkiva ter v procesu fibroze. Eozinofilci imajo torej tako zaščitne kot škodljive funkcije – povzročajo lahko poškodbe tkiv ter hkrati izločajo rastne faktorje, ki sodelujejo pri njihovi obnovi. Za eozionofilce in ostale granulocite so značilne citoplazemske granule, ki služijo kot depo primarnih mediatorjev s številnimi funkcijami. Način sproščanja biološko aktivnih mediatorjev je takojšen in specifičen glede na vrsto stimulusa. Večinski delež kristaloidnih granul predstavljajo kationski proteini. Pomembni predstavnik kristaloidnega jedra eozionofilnih granul je glavni bazični protein 1 (ang. major basic protein 1), ki je osrednja tema dotične magistrske naloge. Protein je sprva postal predmet zanimanja zaradi svoje neselektivne toksičnosti – njegova tarča so tako patogeni mikroorganizmi (npr. bakterije, virusi, paraziti) kot sesalske celice. Opisan mehanizem toksičnosti vključuje vezavo proteina na citoplazemsko membrano, ki ji sledi permeabilizacija membrane, pa tudi pertubacije bakterijske membrane. Njegovo protibakterijsko delovanje ter toksičnost proti gostitelju, kot na primer toksični učinki na bronhialnih epitelijskih celicah v povezavi z astmo, sta bila opisana že desetletja nazaj. Novejša odkritja so prispevala k spoznanju, da eozinofilne kationske proteine, med drugim glavni bazični protein 1, najdemo v kompleksnih zunajceličnih združenjih z mitohondrijsko DNA. Tako imenovane zunajcelične pasti eozinofilcev so zmožne lovljenja in ubijanja zunajceličnih patogenih mikroorganizmov, hkrati pa prispevajo k imunopatologiji eozinofilnih bolezni. Po aktivaciji eozinofilcev, ki ji sledi sprostitev vsebine granul, se v zunajceličnem prostoru tvorijo pasti, proces nastanka le-teh pa ni posledica niti apoptoze niti nekroze. V znanstveni razpravi se pojavljajo nasprotujoči si sklepi o izvoru DNA, prisotne v zunajceličnih pasteh eozinofilcev, ter o zahtevi po celični smrti v povezavi z nastankom pasti. Viabilne celice dokazano sproščajo mitohondrijsko DNA, medtem ko so prisotnost genomske DNA dokazali v zunajceličnih pasteh, ki so se sprostile iz liziranih celic. Nadaljnje preučevanje citotoksičnosti glavnega bazičnega proteina 1 je razkrilo, kako je njegova toksičnost nadzorovana znotraj eozinofilnih granul in kako je le-ta izzvana ob sprostitvi vsebine granul v zunajcelični prostor. In sicer kristalizacija glavnega bazičnega proteina 1 zavira njegovo toksičnost, kadar je ta znotraj granul. Poleg tega visoko urejene kristalinične strukture omogočajo shranjevanje proteina v visoki koncentraciji. Po aktivaciji eozinofilcev, ki ji sledi degranulacija komponent granul pa se protein v zunajceličnem prostoru v procesu samoagregacije pretvarja v netoksične amiloidogene fibrile. Kristalizacija in agregacija sta torej procesa, ki omejujeta toksičnost glavnega bazičnega proteina 1. Hkrati pa zunajcelična agregacija toksičnost ne le zavira, pač pa je tudi ključna za tvorbo predfibrilarnih in fibrilarnih oligomerov, ki predstavljajo toksične intermediate glavnega bazičnega proteina 1. Naši rezultati potrjujejo predhodne ugotovitve, da so spremembe v agregacijskih sposobnostih glavnega bazičnega proteina 1 povezane s spremenjeno toksičnostjo. Poleg tega smo dodali, da je toksičnost proteina linearno sorazmerna z njegovo koncentracijo. Vloga mitohondrijske DNA, ki je del zunajceličnih pasti eozinofilcev, do sedaj še ni bila popolnoma raziskana. Težišče naloge zato predstavlja vpliv bakterijske, človeške genomske in mitohondrijske DNA na toksičnost glavnega bazičnega proteina 1 proti bakterijskim in gostiteljskim celicam. Naše ugotovitve dokazujejo vpliv mitohondrijske DNA na toksičnost glavnega bazičnega proteina 1. Natančneje, dokazali smo, da bakterijska in mitohondrijska DNA povečata ter pospešita toksičnost proteina, medtem ko človeška genomska DNA nanjo nima pomembnega vpliva. Te ugotovitve so nakazovale, da bi metiliranost DNA lahko bila ključna pri pojasnjevanju vpliva bakterijske in mitohondrijske DNA na povečano toksičnost glavnega bazičnega proteina 1. Da bi ocenili, ali je odsotnost metilacije bakterijske in mitohondrijske DNA vzrok za povečano toksičnost, smo proizvedli metilirano bakterijsko DNA ter demetlirano človeško genomsko DNA. Pri tem je pomembno omeniti, da smo vsaki izolirani DNA določili stopnjo metiliranosti z uporabo komercialno dostopnega encimsko-vezanega imunosorbentnega testa. Rezultati omenjenega testa so potrdili nizko stopnjo metiliranosti 5-metilcitozinov bakterijske in mitohondrijske DNA ter visoko stopnjo metiliranosti modificirane metilirane bakterijske DNA. Po drugi strani smo potrdili znatno metiliranost človeške genomske DNA ter nizko stopnjo metiliranosti DNA, ki smo jo izolirali po predhodni izpostaviti zaviralcu metilacije DNA – 5-aza-2′-deoksicitidinu. Vpliv modificiranih DNA na toksičnost glavnega bazičnega proteina 1 smo primerjali z vplivom njihovih nemodificiranih analogov. Rezultati so nedvoumno dokazali, da DNA nizke stopnje metiliranosti, v primerjavi s svojim metiliranim analogom, znatno poveča toksičnost glavnega bazičnega proteina 1. S tem smo potrdili vpliv metiliranosti DNA na toksičnost proteina. Nazadnje smo želeli podrobneje opredeliti molekularni mehanizem celične smrti, ki jo povzroča glavni bazični protein 1, kar smo dosegli tako z uporabo različnih farmakoloških zaviralcev kot tudi s tehniko slikanja živih celic s konfokalno mikroskopijo. Predhodne raziskave navajajo, da je tarča toksičnega delovanja glavnega bazičnega proteina 1 plazemska membrana. Po izpostavitvi glavnemu bazičnemu proteinu 1 so poročali o lizi bakterijskih celic in lokalnih pertubacijah celične membrane ter hkrati opisovali še krčenje gostiteljskih celic, kondenzacijo in fragmentacijo njihovega celičnega jedra. Mehanizmi in signalne poti, ki so del omenjenih procesov, do sedaj še niso bili natančno definirani. Rezultati slikanja s konfokalno mikroskopijo so razkrili hiter mehanizem celične smrti, pri kateri so kot glavne morfološke spremembe prisotne permeabilizacija celične membrane, odlepljanje in krčenje celic ter kondenzacija in fragmentacija celičnega jedra. Omenjena opažanja so vodila do nadaljnjega raziskovanja procesev na citoplazemski membrani, ki potekajo pod vplivom glavnega bazičnega proteina 1 in vodijo v celično smrt. Preizkusili smo številne farmakološke inhibitorje signalnih poti in mehanizmov celične smrti, vključno s punicalaginom in glicinom. Punicalagin, definiran kot stabilizator celične membrane, je pomembno zavrl toksičnost glavnega bazičnega proteina 1. Glicin, kot citoprotektant, ki omejuje rupturo celične membrane, a omogoča njeno permeabilnost, ni imel podobnega učinka. Ti rezultati kažejo, da je mehanizem permeabilizacije membrane kompleksnejši in ni le posledica rupture membrane. Natančen mehanizem celične smrti ostaja nepojasnjen in zahteva nadaljnjo obravnavo.

• Language: Slovenian
• Keywords: glavni bazični protein 1, mitohondrijska DNA, zunajcelične pasti eozinofilcev, metiliranost DNA, permezbilizacija membrane
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2021
• PID: 20.500.12556/RUL-131737
• Publication date in RUL: 02.10.2021

Secondary language

• Language: English
• Title: Molecular interaction between eosinophil major basic protein and DNA

Abstract

Distinctive granules which serve as a depot for diverse presynthesized multifunctional mediators are a hallmark of eosinophils and other granulocytes. A major component of eosinophil crystalloid granules are cationic proteins which exhibit characteristic staining properties. Compelling evidence suggests that these proteins, notably major basic protein 1 (MBP-1), can also be found extracellularly in association with mitochondrial DNA, forming so-called eosinophil extracellular traps (EETs). Aggregates of MBP-1 exert unselective toxicity toward not only pathogens but also host cells, thereby taking part in eosinophil-mediated immunopathologies. The role of mitochondrial DNA, which is believed to be the scaffold of EETs, has not yet been fully explained. Here, we aim to evaluate the effect of isolated bacterial, human genomic, and mitochondrial DNA on MBP-1-mediated toxicity toward E. coli and human epithelial BEAS-2B cells. Our results provide evidence that non- or low-methylated DNA such as bacterial and mitochondrial DNA greatly enhance MBP-1-mediated toxicity. Moreover, demethylated human genomic DNA, compared to its methylated analogue, also increases BEAS-2B and E. coli cell death, implying that DNA-mediated increased MBP-1-mediated toxicity is dependent on its methylation. Evaluation of known cell death signalling pathways and molecular mechanisms reveals that MBP-1 induces rapid cell death, the type of which has yet to be determined. The use of punicalagin, a membrane-stabilizing reagent, reverses MBP-1-mediated toxicity, suggesting membrane permeabilization as a key feature of MBP-1-induced cell death.

• Keywords: major basic protein 1, mitochondrial DNA, eosinophil extracellular traps, DNA methylation, membrane permeabilization