Optimizacija ionizacijskih metod za detekcijo mikotoksinov z uporabo masne spektrometrije

Pavlič, Anže (author), Zega, Anamarija (mentor), Kauppila, Tiina (co-mentor)

Mikotoksini so molekule z majhno molekulsko maso, ki so sekundarni metaboliti gliv. So izredno stabilni in lahko preživijo tudi toplotno obdelavo. Glive okužijo navadno zrnate pridelke, kot so pšenica, rž in koruza. Zaradi njihove pogostosti pojavljanja in tveganja za zdravje živali in človeka agencije, kot so Food and Agriculture Organization of United Nations (FAO), Food and Drug Administration (FDA) in European Food Safety Authority (EFSA), ustvarjajo smernice za njihovo vzorčenje, merjenje ter določajo meje v prehrani in krmi. Znanih je več načinov za določevanje koncentracije mikotoksinov v vzorcu. Poznamo imuno-kemijske metode, ki se uporabljajo rutinsko in so zelo robustne. Med nekoliko bolj zahtevne in natančnejše metode pa uvrščamo kromatografske metode. Te se lahko delijo na tekočinsko ali plinsko kromatografijo ter še glede na način detekcije, in sicer z ultravijolično svetlobo ali masno spektrometrijo. Pri kromatografiji, sklopljeni z masnim spektrometrom, je ključen vmesni korak ionizacije vzorca z ionskim izvorom. Cilj tega magistrskega dela je bila optimizacija nastavitev masnega spektrometra Agilent’s 6300 Ion Trap za analizo mikotoksinov z LC/MS metodo. Preučevali smo dve metodi ionizacije mikotoksinov: desorpcijsko ionizacijo z razprševanjem v električnem polju (DESI) ter desorpcijsko foto ionizacijo pri atmosferskem tlaku (DAPPI). Pri obeh metodah smo želeli optimizirati nastavitve masnega spektrometra tako, da v vzorcu zazna določen mikotoksin ter prikaže čim bolj intenziven signal. Nastavitve smo optimizirali s pomočjo ionizacijskih metod: ionizacijo z razprševanjem v električnem polju (ESI), foto ionizacijo pri atmosferskem tlaku (APPI) ter APPI z mikročipom (µAPPI). Zaradi konstantnega pretoka vzorca skozi ionizator v masni spektrometer smo lahko z omenjenimi ionizacijami raziskali optimalne nastavitve za posamezni mikotoksin ter celo izvedli njihovo nadaljnjo fragmentacijo na manjše ione. To smo storili tako, da smo nastavili masni spektrometer na želeno tarčno molekulsko maso iona. Ta je nato za vsak parameter spreminjal območje napetosti. Vrednost, ki je podala največji signal, je shranil ter nadaljeval z naslednjim parametrom masnega spektrometra. V magistrski nalogi smo se osredotočili na optimizacijo parametrov za metodi DESI in DAPPI, za mikotoksine deoksinivalenol, nivalenol, T-2 toksin, HT-2 toksin ter zearalenon. Uporabili smo že pripravljene raztopine mikotoksinov določenih koncentracij; pripravljenih je bilo tudi več različnih topil in dopantov, med katerimi smo v sklopu optimizacije izbrali najustreznejšega. Pri metodah DESI in DAPPI smo vzorce nanesli neposredno na ploščice, kjer so se posušili. Tako pripravljene ploščice smo postavili na nastavljivo stojalo, priključeno na masni spektrometer. Na ploščice smo nato pod kotom usmerili mešanico nosilnega plina ter dopanta, ki je ioniziral vzorec ter ione ponesel v masni spektrometer. Ker vzorci niso bili razporejeni čez celotno ploščico, smo poleg spektra vzorca posneli tudi spekter ozadja, ki smo ga lahko nato s pomočjo programske opreme odstranili in tako dobili boljši grafični prikaz rezultatov. Pri nekaterih meritvah z ESI, APPI in µAPPI nismo uspeli dobiti jasnega signala za določen mikotoksin, čeprav smo poskusili vse možne optimizacije nastavitev. V pomoč pri pridobitvi signala so bili adukti nastalih ionov, na osnovi katerih smo lahko optimizirali nastavitve parametrov spektrofotometra. Nekaterih meritev zaradi pomanjkanja mikročipov in založnih raztopin mikotoksinov nismo uspeli dokončati. Optimizacijo metod DESI in DAPPI lahko označimo kot uspešno, saj smo za večino vzorcev pri meritvah dobili rezultate, ki so ustrezno prikazali vsebnost določenega mikotoksina ali njihovih fragmentov ter aduktov. Edini problematični mikotoksin je bil nivalenol, kjer je ion ozadja z enako maso kot masa iona nivalenola motil optimizacijo. Proti koncu raziskovalnega dela smo odkrili potencialno rešitev za ta mikotoksin z merjenjem njegovega formatnega adukta, vendar je za meritve zmanjkalo delujočih mikročipov. V primerjavi z DESI se je DAPPI metoda izkazala za učinkovitejšo, saj so bili odzivi vzorcev z njo intenzivnejši. V sklopu našega dela bi optimizirane metode lahko uporabili za nadaljnje določanje mej zaznavanja DESI in DAPPI ter raziskovanje vsebnosti mikotoksinov na surovih vzorcih različnih žitaric.

• Language: Slovenian
• Keywords: mikotoksini, ionizacija, masna spektroskopija, DESI, DAPPI
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2021
• PID: 20.500.12556/RUL-125351
• Publication date in RUL: 12.03.2021

Secondary language

• Language: English
• Title: Optimization of ionization methods for mycotoxin detection using mass spectrometry

Abstract

Mycotoxins are toxic secondary metabolic products of Fungus species. In food (human or feed), they are mostly found on crops as a result of a fungal infection. The crop can be infected during the growth period or while it is stored under inappropriate conditions after the harvest. Because the toxicity of mycotoxins in high dosages can lead to different diseases or in worst cases death, the detection of them is essential. Many worldwide agencies that are involved in health, food safety, and agriculture (European Food Safety Authority (EFSA), Food and Agriculture Organization of United Nations (FAO), etc.) release guidelines with the maximum allowed concentrations for mycotoxins in food and feed and also for their sampling and measuring. Many methods for sampling and measuring were already developed ranging from simple detections with enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) on a commercial strip to complex liquid chromatography-mass spectrometry methods (LC-MS methods). Before we can analyze the sample with a mass spectrometer (MS), we must prepare it with an ionization process. The mass spectrometry method measures the mass-to-charge ratio (m/z) of charged particles (ions). Mass spectrometer with electric and magnetic field divides ions in the sample by their mass and displays them on the computer as peaks of different intensity in the graph. The aim of this thesis was the optimization of MS parameters for detection of mycotoxins Deoxynivalenol, Nivalenol, T-2 toxin, HT-2 toxin, and Zearalenone using desorption electrospray ionization (DESI) and desorption atmospheric pressure photo-ionization (DAPPI). The optimization was performed using electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure photo-ionization (APPI), and microchip APPI (µAPPI) as preparation methods. Besides MS parameters variations, different spraying solvents and dopants were tested. The setup for DESI and DAPPI was constructed from moving modules, which allowed us to move our sample in front of MS and also test different plate surfaces, on which the samples were presented. The results of this thesis could be used for further analysis of DESI and DAPPI limits of detection (LoDs) and further detection of mycotoxins on infected food and feed.

• Keywords: mycotoxin, ionization, mass spectrometry, DESI, DAPPI