Celično jedro je največji organel evkariontskih celic, obdan z jedrno ovojnico (NE, Figure 1), dvojno koncentrično membrano, sestavljeno iz zunanje jedrne membrane (ONM), ki je povezana z zrnatim endoplazemskm retikulumom (ER), in notranje jedrne membrane (INM), v katero so vgrajeni številni proteini, ki pomagajo pri sidranju jedrne lamine (NL) in kromatina k obrobnemu delu jedra. Med ONM in INM je perinuklearni prostor (PNS), ki se nadaljuje v lumen ER. Prehajanje molekul med jedrom in citoplazmo poteka skozi jedrne pore, stičišča obeh membran, kjer se številni proteini, imenovani nukleoporini, povezujejo v makromolekularne komplekse jedrnih por, ki omogočajo dvosmerni aktivni transport molekul. Pod INM leži NL, omrežje intermediarnih filamentov (laminov), ki daje jedru mehansko podporo, omogoča prenos in ojačitev signalov med jedrom in citoskeletom in je vključeno v organizacijo kromatina, umeščanje in izražanje genov, celično signalizacijo, celični cikel, podvajanje DNA in številne druge celične procese. Za povezavo med nukleoskeletom in citoskeletom skrbi kompleks LINC, ki se s povezavami med proteini z domeno SUN in s proteini z domeno KASH (nesprini) razteza skozi obe membrani NE. Proteini z domeno SUN se v jedru vežejo na lamine, kromatin-vezavne proteine in druge proteine INM, v PNS pa se povežejo z nesprini, ki so v citoplazmi vezani na omrežja citoskeleta (mikrotubule, aktinske in intermediarne filamente). Kompleks LINC igra ključno vlogo v številnih celičnih procesih, organizaciji kromosomov in diferenciaciji.
Genomska DNA je v evkariontskih celicah organizirana v kromatin, ki je sestavljen iz DNA in proteinov. Bolj zgoščen, transkripcijsko utišan kromatin, se imenuje heterokromatin in se nahaja v obrobnem delu jedra in okoli jedrca, transkripcijsko aktiven in manj zgoščen kromatin pa se imenuje evkromatin in se nahaja v osrednjem delu jedra. Organizacija kromatina je uravnavana preko različnih epigenetskih mehanizmov: metilacije DNA (kovalentni prenos metilne skupine na mesto 5C citozina, kar zniža prepisovanje genov), posttranslacijskih modifikacij histonov (med katerimi so najpogostejše acetilacija, metilacija in ubikvitinacija lizinov), različnih histonskih oblik, in delovanjem nekodirajočih RNA. Organizacija in regulacija kromatina je ključnega pomena za stabilnost in pravilno izražanje genov, za opravljanje celičnih funkcij, celično diferenciacijo in specializacijo. Pomembno vlogo pri organizaciji kromatina igra NE, ki s pomočjo laminov in transmembranskih proteinov jedrne lamine (NET-ov) privezuje kromatin k obrobnemu delu jedra. Razporeditev kromosomov v jedru ni naključna. V jedru sesalskih celic so kromosomi z manjšim številom genom pomaknjeni v jedrno periferijo, med tem ko so kromosomi, ki vsebujejo večji delež genov, locirani v osrednjem delu jedra. Celice različnega tkiva imajo različno prostorsko razporeditev kromosomov in organizacijo kromatina, saj sta le-ti odvisni od diferenciacije in specializacije celic. Med procesom celične diferenciacije pride do velikih sprememb v organizaciji kromatina. Medtem ko je kromatin matičnih celic zarodka (ESC) ohlapno zvit, brez značilnih območij heterokromatina, je v diferenciranih celicah v jedrni periferiji in okoli jedrca kromatin bolj strukturiran in kondenziran. V procesu diferenciacije se tako reorganizira več kot tretjina genoma.
NE je dolgo časa veljala le za ločnico med jedrom in citoplazmo, dokler niso pred leti odkrili, da mutacije številnih NET-ov povzročajo bolezni jedrne ovojnice oz. jedrne lamine (envelopatije oz. laminopatije). Večina NET-ov je tkivno specifičnih, njihovo izražanje pa je odvisno od razvojne faze celic. Med najbolje raziskanimi NET-i so proteini z domeno SUN, proteini z domeno LEM (LAP2β, Emerin, MAN1), receptor lamina B (LBR) in Samp1, ki sodelujejo pri sidranju kromatina k NL. Samp1 (z vretenom povezan membranski protein 1) je prvi protein, ki so ga našli v delitvenem vretenu. Ima tri različne izooblike: Samp1a (43 kDa), Samp1b (62 kDa) in Samp1c (75 kDa), ki so produkti alternativnega spajanja. Samp1 ima velik nukleoplazmični N-konec s hidrofobno domeno, štiri ohranjene CXXC motive s potencialom za nastanek dveh cinkovih prtov in vezavo RNA/DNA in/ali proteinov; Samp1a in Samp1b imata štiri transmembranske domene in nukleoplazmični C-konec, med tem ko ima Samp1c pet transmembranskih domen in C-konec v PNS (Figure 2). Izguba Samp1 destabilizira delitveno vreteno, kar povzroči napačno ločitev kromosomov. Samp1 je povezan tudi z kompleksom LINC in lamini; izguba Samp1 povzroči destabilizacijo kompleksa LINC, kar onemogoči migracijo fibroblastov in odmik centrosoma proč od jedra. Izražanje proteina Samp1 je tkivno specifično, z visoko ravnjo izražanja v mišicah, možganih in testisih. Ključen je za diferenciacijo mišic, raven izražanja se med miogenezo za nekajkrat zviša, izguba proteina pa prepreči nastanek miocevk in s tem popolnoma prepreči miogenezo. Pomembno vlogo naj bi imel tudi pri sidranju heterokromatina na jedrno periferijo.
Za kvantitativno spremljanje dinamične razporeditve kromatina v celicah smo uporabili metodo FRIC (fluorescentno ratiometrično slikanje kromatina). Metoda temelji na uporabi označevalcev za transkripcijsko aktiven kromatin H3.3-EGFP (Figure 4a) in splošen kromatin H2B-mCherry (Figure 4b), ki sta klonirana v vektor pTandemH (Figure 3), ki omogoča njuno stehiometrično konstantno izražanje. Program za analizo slik omogoča avtomatiziran izbor celic, katerih jedra ustrezajo željeni velikosti in se ne dotikajo roba slike. Nato izračuna površino jeder in intenziteto rdeče (H2B-mCherry) oz. zelene (H3.3-EGFP) fluorescence. Slike se normalizirajo z deljenjem posamezne fluorescence z njeno povprečno vrednostjo in varianco posameznih jeder. Normalizirana zelena fluorescenca (kanal H3.3) se nato deli z normalizirano rdečo fluorescenco (kanalom H2B), pri čemer nastane slika razmerij, ki prikazuje relativno epigenetsko stanje kromatina (Figure 4c). Jedro se nato razdeli v 20 ali 40 koncentričnih območij z enako širino. Povprečne vrednosti teh območij se nato načrtajo od jedrne periferije do središča jedra (1-20 oz. 1-40), s čimer nastane radialni profil, ki prikazuje kvantitativno porazdelitev kromatina v jedru celic.
V prvem delu magistrske naloge je predstavljena izboljšana metoda FRIC z uporabo 75. percentila razmerja H3.3/H2B, ki predstavlja evkromatin (Figure 4d), in 75. percentila razmerja H2B/H3.3, ki predstavlja heterokromatin (Figure 4e), ki sta združena v eno sliko (Figure 4f). Heterokromatin je na sliki obarvan z rumeno, evkromatin pa s turkizno barvo, s čimer je porazdelitev kromatina v jedru celic predstavljena bolj jasno in razločno. Izboljšavo metode smo eksperimentalno ponazorili s pomočjo inhibitorjev histon deacetilaze (HDAC) in histon acetiltransferaze (HAT). Celice HeLa smo transficirali z vektorjem pTandemH in obdelali z inhibitorjem HDAC TSA oz. inhibitorjem HAT AA. Dodatek TSA (ki zviša raven acetilacije histonov) je povzročil upad perifernega heterokromatina, dodatek AA (ki zmanjša raven acetilacije histonov) pa je imel obraten efekt, nastalo je več heterokromatina v jedrni periferiji (Figure 5).
S pomočjo izboljšane metode FRIC smo v nadaljevanju opazovali spremembe v organizaciji kromatina med nevrogenezo. Nevronski celični liniji SH SY5Y in PC6-3 smo transficirali z vektorjem pTandemH in diferencirali. Po petih dneh diferenciacije smo opazili porast perifernega heterokromatina v jedru obeh celičnih linij (Figure 6-7). Rezultati večine dosedanjih študij opisujejo spremembe v organizaciji kromatina v začetnih fazah razvoja, z našimi poskusi pa smo uspeli ponazoriti tudi spremembe v organizaciji kromatina v dokaj pozni fazi nevronske diferenciacije, ko ne prihaja več do tako znatnih sprememb v organizaciji kromatina kot v zgodnejših fazah razvoja.
Iz literature je znano, da je Samp1 pomemben za diferenciacijo človeških induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC) in mišic, pripisujejo mu pomembno vlogo pri organizaciji kromatina. Zato smo preverili imunofluorescenčno raven proteina Samp1 med nevrogenezo in opazili značilen porast pri diferenciaciji celic PC6-3 (Figure 8). Za nadaljnje poskuse smo nato ustvarili poliklonsko celično linijo PC6-3 z izbitim genom za Samp1 (CrisprCas9 KO-Samp1, Figure 9). Kljub izbitju gena za Samp1, so se celice normalno diferencirale, s čimer smo pokazali, da Samp1 ni esencialen za nevrogenezo celic PC6-3. Zanimivo pa je bilo dognanje, da pri diferenciaciji celic z izbitim genom za Samp1 ne pride do značilnega porasta perifernega heterokromatina, kot ga je mogoče opaziti pri divjemu tipu celic, kljub normalni diferenciaciji celic. Prav tako smo opazili, da imajo nediferencirane celice z izbitim genom za Samp1 manj heterokromatina v jedrni periferiji v primerjavi z nediferenciranimi celicami divjega tipa, kar ponazarja, da Samp1 spodbuja nastanek perifernega heterokromatina v celičnem jedru.
Da bi ugotovili kako protein Samp1 interagira s kromatinom (bodisi preko vezavnih partnerjev NE ali preko direktne vezave), smo pripravili jedrni fragment proteina Samp1, YFP-Samp1 (1-180), brez transmembranskih domen. Analiza izražanja jedrnega fragmenta v celicah U2OS je pokazala višjo kolokalizacijo YFP Samp1 (1-180) z Draq5 (markerjem kromatina) in H3K9me3 (markerjem heterokromatina), kot z YFP, kar nakazuje na direktno interakcijo proteina Samp1 s heterokromatinom, brez pomoči vezavnih partnerjev.
Prva odkrita bolezen, ki jo povzročajo mutacije NET-ov, je bila Emery Dreifuss mišična distrofija (EDMD). Večina primerov bolezni je povezana z mutacijami emerina ali lamina A/C, za ostale primere pa je vzrok neznan. Simptomi EDMD so otrdelost sklepov, progresivna izguba mišične mase in mišična oslabelost, ter bolezni srca, kar na koncu privede do odpovedi srca. Nedavno so odkrili, da so mutacije gena, ki kodira protein Samp1, povezane z zgodnejšim pojavom simptomov in resnejšim potekom EDMD. Gre za substitucije glicina z alaninom ali serinom, kar bi lahko povzročilo stabilizacijo strukture Samp1.
Da bi ugotovili mehanizem vpliva mutacij proteina Samp1 na resnejši potek EDMD, smo preverili lokalizacijo mutiranih proteinov Samp1 v celicah HeLa in U2OS. Med mutiranimi in nemutirano obliko proteina nismo opazili razlik (Figure 12), prav tako ni bilo mogoče zaznati značilnih sprememb v morfologiji ali velikosti jedra, kar bi nakazovalo na napake pri mitotski delitvi. Izguba proteina Samp1 običajno povzroči agregacijo emerina, ki je direktni vezavni partner Samp1 in eden izmed glavnih proteinov, katerih mutacije povzročajo nastanek EDMD. Medtem ko je prekomerno izražanje Samp1 povzročilo porast v številu celic z agregati emerina v celičnih linijah HeLa (21 % celic) in U2OS (75 % celic), mutirane oblike proteina Samp1 niso imele nobenega dodatnega vpliva na agregacijo (Figure 13). Iz prejšnje literature je znano, da izguba proteina Samp1 povzroči odmik centrosoma od jedra, kar je značilen fenotip celic bolnikov z EDMD. Naši rezultati v celicah HeLa so to potrdili. Do odmika centrosoma od jedra je v celicah HeLa prišlo tudi pri prekomernemu izražanju YFP-Samp1 (Figure 14), medtem ko se je centrosom v celicah U2OS s prekomernim izražanjem YFP-Samp1 pomaknil bližje k jedru. Prekomerno izražanje mutiranih oblik Samp1 ni imelo dodatnega učinka na položaj centrosoma v primerjavi z nemutirano obliko proteina v nobeni od uporabljenih celičnih linij.
V magistrski nalogi smo z izboljšano metodo FRIC pridobili bolj jasno predstavo o organizaciji kromatina v jedru analiziranih celic. Pokazali smo, da je z izboljšano metodo FRIC mogoče zaznati občutljive spremembe v organizaciji kromatina tudi v poznejših fazah diferenciacije, ko spremembe v porazdelitvi hetero- in evkromatina niso več tako velike. V nalogi smo pokazali porast heterokromatina v jedrni periferiji med nevrogenezo in vlogo proteina Samp1 pri sidranju perifernega heterokromatina k NE. Rezultati prav tako nakazujejo na direktno interakcijo med proteinom Samp1 in kromatinom brez pomoči vezavnih partnerjev v NE. V zadnjem delu smo se osredotočili na mutacije proteina Samp1, ki so jih odkrili pri bolnikih z EDMD. Prekomerno izražanje YFP Samp1 je povzročilo agregacijo emerina v celicah HeLa in U2OS. Pri prekomernem izražanju YFP-Samp1 smo opazili tudi spremembe v položaju centrosoma, v celicah HeLa je prišlo do povečanja razdalje, medtem ko v celicah U2OS do zmanjšanja razdalje med centrosomom in jedrom, kar je v skladu s hipotezo o tkivno-specifičnih funkcijah proteina Samp1.
|
