Merjenje peroksidazne aktivnosti nekovalentno povezanih hem-peptidnih kompleksov

Družeta, Ivona (author), Sollner Dolenc, Marija (mentor), Kühl, Toni (co-mentor)

Hem predstavlja pomembno prostetično skupino raznovrstnih proteinov, najbolj znanih po svojih vlogah pri transportu kisika, transportu elektronov, oksidaciji substratov ter uravnavanju aktivnosti različnih proteinov. Ne-vezan prosti hem je hidrofoben in zelo toksičen za celice. Sprostitev prostega hema iz znotrajceličnih hemoproteinov in prisotnost redoks-aktivnega železa je znana pri nekaterih patoloških stanjih in so le-ti tudi vzrok za simptome teh stanj. Zaradi nenehnega nastajanja reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) prosti hem vodi do spremembe oz. poškodbe lipidov, proteinov in DNK. Peroksidaze so skupina encimov, ki vsebujejo hem, in imajo pomembno vlogo pri številnih ključnih fizioloških procesih, kot so odstranjevanje oksidantov (vodikov peroksid), so pa povezani tudi z nastajanjem ROS. Pri peroksidaznih reakcijah porfirinska molekula s hemskim železom v središču lahko služi kot vir elektronov. Ugotovili so, da se hem lahko veže na kratka zaporedja v proteinih (angl. heme regulated motifs (HRM)) in tvori komplekse s proteini, ki imajo različne biokemične funkcije. Hem v kompleksih z različnimi peptidi lahko povzroči povečanje njihove peroksidazne aktivnosti, kar lahko vodi do številnih patofizioloških procesov. Cilj našega dela je bil raziskovanje vezave hema na proteine ter natančnejše preučevanje aminokislinskih zaporedij, na katere se veže hem. Najpogostejše aminokisline, ki so prisotne v vezavi hema na protein/peptid, so cistein, histidin, tirozin in metionin, ki lahko služijo kot koordinacijski aksialni ligandi hemskemu železu. Različne strukturne študije hemskih-peptidnih kompleksov so omogočile določitev koordinacijskega stanja hemskega železa in pomagale pri sestavi kombinatorične knjižnice nonapeptidov, ki jih je pripravil Kühl s sodelavci leta 2011. V naslednji študiji Brewitza in sodelavcev leta 2015 je bilo določenih osem razredov HRM z upoštevanjem položaja osrednje koordinirajoče aminokisline in prisotnosti ali odsotnosti dodatnih sosednjih aminokislin. Poudarek našega dela je bil na preučevanju teh kratkih aminokislinskih zaporedij iz že uveljavljenih razredov (VI – VIII). Z nadaljnjimi raziskavami na tem področju so Syllwasschy in sodelavci razširili razdelitev in dodali nove štiri podrazrede (A – D), ki se delijo glede na različno dolžino vmesnikov (oz. število aminokislin) med dvema koordinacijskima aminokislinskima ostankoma v peptidnem zaporedju. Tako smo v našemu delu proučevali učinke zaporedij peptidov iz podrazredov A in C. Z uporabo spektroskopije UV-vis smo merili peroksidazno aktivnost teh kompleksov hem–peptid in proučevali kinetiko pretvorbe substratov v njihovi priostnosti. Uporabljeni testi so temeljili na merjenju peroksidazne aktivnosti z uporabo dveh substratov, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) in vodikovega peroksida (H2O2). Naša skupina izbranih peptidov na osnovi koordinacijskih aminokislin histidina in tirozina ni pokazala pomembnega povečanja peroksidazne aktivnosti, največjo peroksidazno aktivnost imata podrazreda B in D, ki imata koordinirajoči aminokislini, oddaljeni med seboj za enega ali tri aminokislinske preostanke. Preučevali smo tudi kinetiko pretvorbe izbranih substratov v prisotnosti kompleksov hem-peptid, ki so v testih merjenja peroksidazne aktivnosti pokazali pomembno zvišanje peroksidazne aktivnosti. Testi so bili opravljeni za dva substrata, TMB in vodikov peroksid, pri čemer smo določili standardni kinetični konstanti (KM, kcat) za vsak kompleks posebej. Iz našega preizkusa je mogoče razbrati, da lahko povečanje reaktivnosti dosežemo s kombiniranjem visokega kcat in nizkega KM za drugi substrat. V študijah kinetike za vodikov peroksid je bila opažena razlika v stabilnosti pri nekaterih kompleksih hem-peptid pri visokih koncentracijah vodikovega peroksida. Tako so kompleksi z visokim pretvorbenim številom (kcat) za H2O2 pokazali nižjo stabilnost pri visokih koncentracijah H2O2 (neodvisno od KM), za katero predvidevamo, da so posledica nizke katalitične učinkovitosti drugega substrata. Kljub svoji zelo pomembni vlogi v človeškem organizmu hem lahko s tvorbo reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) povzroči toksičnost in s tem različna patofiziološka stanja. Zato je potrebno prepoznati mehanizme za pojav različnih patofizioloških stanj, ki jih povzroča hem in s tem tudi omogoči ustrezno zdravljenje. Določitev izbranih kinetičnih parametrov kompleksov hem-peptid je pomembna ne le za oceno delovanja takih kompleksov v organizmu, temveč tudi za razvoj potencialnih biokatalizatorjev, ki lahko temeljijo na takšnih reakcijah. Vendar raziskovanje regulacije hema vezanega na proteine še vedno predstavlja večinoma neznano področje, zato zahteva nadaljnje raziskave, tudi na področju identifikacije in optimizacije študij na nonapeptidih.

• Language: Slovenian
• Keywords: peroksidazna aktivnost, hem-regulacijski motiv (HRM), kompleks hem-peptid, kinetika Michaelis-Menten
• Work type: Master's thesis/paper
• Organization: FFA - Faculty of Pharmacy
• Year: 2020
• PID: 20.500.12556/RUL-121344
• Publication date in RUL: 05.10.2020

Secondary language

• Language: English
• Title: Measuring of non-covalently-linked heme-peptide-complexes' peroxidase activity

Abstract

Heme is an important prosthetic group of various proteins, best known for its roles in oxygen transport, electron transport, and substrate oxidation. In peroxidase reactions, the porphyrin molecule with heme iron in the center serves as an electron source. Nonprotein-bound free heme is hydrophobic and highly toxic to human cells. However, heme was described as an important signaling molecule that can interact and regulate the activity of distinct proteins (regulatory heme). Regulatory heme can bind to short sequence stretches in proteins (HRMs), forming a transient complex with proteins involved in diverse biochemical processes. We aimed to further explore transient heme binding to proteins applying peptides as model systems to investigate heme-protein interactions. In addition to a variety of processes in which heme acts as a regulatory effector, particular attention should be given to its peroxidase-like activity, which may cause many pathophysiological conditions in humans (e.g. Alzheimer's disease, Parkinson's disease, autoimmune diseases, etc.). With UV-vis spectroscopy, the catalytic activity was determined by measuring the peroxidase activity of heme-peptide complexes. Moreover, by performing studies on the kinetics of the substrate conversion for heme-peptide complexes that exhibited significant peroxidase activity, the standard kinetic constants (KM, kcat) for each complex were described. Our set of selected histidine- and tyrosine-based nonapeptides showed no significant increase in peroxidase activity. However, another set of nonapeptides was further investigated for complex kinetics of two substrates, TMB and hydrogen peroxide. The overall ranking in peroxidase activity was confirmed for both substrates. Finally, kinetics for peptides with higher peroxidase activity improve in both, KM (affinity) and kcat (productivity). This allowed a more precise description and comparison of heme-peptide complexes with peroxidase activity, a prospective area for future scientific development and further research.

• Keywords: heme, peroxidase activity, heme-regulatory motif (HRM), heme-peptide complex, Michaelis-Menten kinetics