Kardiovaskularne bolezni danes predstavljajo enega izmed svetovnih zdravstvenih problemov. Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) vsako leto zaradi kardiovaskularnih zapletov umre 17.5 milijona ljudi [1]. 40% teh pacientov se istočasno srečuje tudi s sladkorno boleznijo tipa II, saj so dejavniki tveganja za razvoj srčno-žilnih bolezni in diabetesa podobni. Pri teh je tveganje za umrljivost petkrat večje kot pri bolnikih s srčno-žilnimi obolenji, ki nimajo sladkorne bolezni. Nedavne raziskave z zdravilom eksenatid, ki je sicer indicirano za zdravljenje diabetesa tipa II, so pokazale, da eksenatid zmanjša tveganje za srčno-žilne dogodke in izboljša funkcijo srca pri bolnikih s kongestivnim srčnim popuščanjem [2]. Poleg uspešne terapije uravnavanja krvnega sladkorja je torej eksenatid pokazal tudi kardioprotektivne učinke. Wallner in kolegi so prišli do sklepa, da eksenatid povzroči spremembe v fosforiliaciji s kalcijem uravnavanih proteinov v srčni mišici, kar poveča srčno kontrakcijo [3]. Eksenatid je inkretinski mimetik. Je agonist receptorja glukagonu-podobnega-peptida-1 (GLP-1). Ti receptorji se nahajajo tudi v srčno-mišičnih celicah. Naš cilj je bil ugotoviti, ali 6.0 nM koncentracija eksenatida vpliva na fosforilacijo proteinov, povezanih s kalcijevimi signalnimi potmi v srcu, in kolikšen je ta vpliv. Kalcij je znotrajcelični sekundarni prenašalec, ki na celičnem oziroma molekularnem nivoju uravnava mnogo procesov. Je pomemben faktor v procesu električnega signaliziranja, apoptoze, transkripcije genov in med drugim uravnava tudi mišično kontrakcijo, tako skeletne kot tudi srčne mišice. Pred več kot stoletjem je Ringerjeva raziskovalna skupina prišla do sklepa, da brez kalcija srčna mišica ni zmožna kontrakcije [4]. Rezultati nedavno opravljenih študij so potrdili, da motnje v uravnavanju kalcijevih ionov v srčni mišici lahko vodijo do kardiovaskularnih zapletov, na primer aritmij in celo do srčnega zastoja [5]. Če nepravilnosti v uravnavanju koncentracije kalcijevih ionov zunaj in znotraj celice ostajajo dalj časa, lahko to vpliva na izražanje proteinov in celično rast ter vodi do celične smrti.
Kalcijevi ioni so vključeni v proces sklopitve vzburjenja srčno-mišičnih celic in kontrakcije srčne mišice. Srčna mišica ali miokard je posebna prečno-progasta mišica. Osnovna enota miokarda je sarkomera, ki vsebuje aktinske in miozinske filamente. Srčno tkivo sestavljajo srčno-mišične celice oziroma kardiomiociti, ki so obdani s posebno ovojnico - sarkolemo. Med celicami, ki so med seboj ločene z t.i. interkalarnimi diski, se nahajajo presledkovni stiki, ki omogočajo hiter prenos akcijskega potenciala. Ko se doseže nadpražni stimulus, se zaradi vala depolarizacije skrči celotna srčna mišica. Srce je torej funkcionalno sincicij. Podaljšanja sarkoleme v notranjost kardiomiocitov tvorijo prečni membranski sistem ali T-sistem. Ta vsebuje različne ionske kanale, med drugim tudi kalcijeve. Večina kalcija je v srčno-mišični celici shranjenega v sarkoplazemskem retikulumu (SR). V stadiju mirovnega membranskega potenciala tako znotrajcelična koncentracija kalcijevih ionov znaša okoli 100.0 nM in zunajcelična okoli 1.5 mM. Ko se kardiomiociti vzdražijo in se preko njih prenese akcijski potencial, kalcijevi ioni vstopijo v celico preko Na+-Ca2+-izmenjevalca (NCX) ali preko kalcijevih kanalčkov tipa L (dihidropiridinskih receptorjev, DHPR), ki se nahajajo v T-sistemu. Ta rahel dvig koncentracije kalcija (10 – 20 μM) sproži t.i. s kalcijem inducirano sproščanje kalcija iz SR-ja (»calcium induced calcium release« oz. CICR) prek posebnih ionskih kanalčkov t.i. rianodinskih receptorjev (RyR). RyR so 2.5 MDa veliki ionski kanali na membrani SR-ja, ki so odgovorni za prenos kalcija iz SR-ja v citosol. Na odpiranje RyR vpliva mnogo dejavnikov, med drugim tudi fosforilacija kanala. β-adrenergična stimulacija srca preko povišanja cikličnega adenozinmonofosfata (cAMP) vodi do aktivacije fosfokinaze A (PKA), ki je zmožna fosforilacije različnih proteinov. Pomemben protein, ki je tudi zmožen fosforilacije peptidov, ki urejajo delovanje kalcija, je kalcij/kalmodulin-odvisna-kinaza (CaMKII). Mesto fosforilacije za PKA je na rianodinskih receptorjih na serinu 2808 (Ser2808) in mesto fosforilacije za CaMKII na serinu 2814 (Ser2814). Povišana koncentracija Ca2+ v citosolu (200 – 400 μM) povzroči krčenje srčne mišice. Ca2+ se namreč vežejo na kompleks troponina, ki ga sestavljajo troponin C, T in I. Kalcij se veže na troponin C in to povzroči konformacijsko spremembo v kompleksu. Troponin I se premesti in tako izpostavi vezavno mesto za miozin na aktinskih filamentih. ATP se veže na miozin in aktinska vlakna zdrsijo proti centru sarkomere, kar povzroči krčenje mišice. Pri β-adrenergični stimulaciji srca PKA in PKC fosforilirata serin 23 in 24 na troponinu I. To vpliva na vezavno afiniteto Ca2+ na troponin C ter vodi do povečanega luzitropnega učinka srčne mišice. Pri relaksaciji srčne mišice se morajo kalcijevi ioni odstraniti iz citosola. Večina se jih prečrpa nazaj v SR preko sarko/endoplazmatski retikulum-Ca2+-ATPaze (SERCA), ki leži na membrani SR-ja. V srcu najdemo izoformo SERCA2α, njeno delovanje uravnava protein fosfolamban (PLB). Nefosforiliran PLB alosterično inhibira delovanje SERCA2α. Nefosforilirana oblika PLB torej zmanjša, fosforilirana oblika pa zveča črpanje kalcijevih ionov nazaj v SR. Tako kot RyR je tudi PLB lahko fosforiliran preko PKA ali CaKMII. Mesto fosforilacije za protein kinazo A je na serinu 16 (Ser16) in mesto fosforilacije za CaMKII je na treoninu 17 (Thr17). Pregledali smo vpliv 6.0 nM raztopine eksenatida na fosforilacijo PLB in RyR, ki sta dva najpomembnejša proteina pri uravnavanju koncentracije kalcija v celici. Ker so receptorji za eksenatid z G-proteinom sklopljeni receptorji, smo preverili vpliv eksenatida na protein kinazo B (AKT). Da bi raziskali, ali ima eksenatid vpliv tudi na proteine, ki ležijo v drugih celičnih predelih, smo ugotavljali vpliv na fosforilacijo troponina I. Eksperimente smo izvajali v levem atriju in levem ventriklu. Levi del srca črpa s kisikom bogato kri po telesu in je tudi bolj nagnjen k srčno-žilnim zapletom in hipertrofiji. Ugotavljali smo tudi razlike v vplivu eksenatida v atrijih in ventriklih. Objavljeni raziskovalni podatki kažejo, da ima eksenatid večji vpliv na atrijske miocite kot na celice v srčnem prekatu [3]. Pri raziskovalnem delu smo uporabili srce zdravih Wistar Kyoto podgan. Izolirano srce smo namestili v Langendorffov perfuzijski sistem s konstantnim pretokom 3 mL/min. Pri kontrolnih vzorcih smo srce izpostavili Tyrodovi raztopini, pri vzorčnih srcih pa smo srce obremenili z 6.0 nM koncentracijo eksenatida v Tyrodovi raztopini (glej Sliko 6). Sledila je sekcija srca, ločili smo tkivo ventriklov in atrijev ter tkivo homogenizirali. Prisotnost in količino fosforiliranih proteinov v homogeniziranem tkivu smo ugotavljali s prenosom western. Vsak eksperiment je bil narejen v duplikatu. Končni rezultati so podani združeno in izhajajo iz dveh med seboj neodvisnih eksperimentov. Kvantifikacijska analiza je bila narejena v programu ImageLab denzitometrično. Končne podatke smo obdelali s statističnim programom GraphPrism. Pri raziskavi vpliva eksenatida na fosforilacijo RyR smo ugotovili, da 6.0 nM koncentracija eksenatida poveča fosforilacijo Ser2808 v levem ventriklu. Ser2808 je mesto PKA fosforilacije in je obenem lahko fosforilirano tudi iz strani CaMKII. Rezultati že opravljenih študij preučujejo možnost, da povišana fosforilacija na Ser2808 zveča možnost odprtja rianodinskih kanalov, kar bi imelo za posledico povečanje toka Ca2+ iz SR-ja v času sistole in povečano kontrakcijo srčne mišice. Obstaja tudi verjetnost, da je povečana fosforilacija Ser2808 pri srčnih boleznih lahko vzrok za aritmije, saj se RyR spontano odprejo tudi v času diastole in prepuščajo kalcijeve ione iz SR-ja v citosol. Natančna vloga fosforilacije Ser2808 še ni popolnoma raziskana in zahteva nadaljnje študije. Eksenatid na drugih mestih fosforilacije pri RyR ni povzročil statistično značilnih razlik. Spremembe smo opazili torej le v levem ventriklu, kar nas je presenetilo, saj trenutne raziskave kažejo, da 6.0 nM koncentracija eksenatida vpliva na fosforilacijo proteinov v levem atriju [3]. Razlog za odsotnost sprememb v fosforilaciji bi bil lahko drugačna mikroarhitektura kardiomiocitov atrija in ventrikla, pomanjkanje fosfodiesteraz v celicah atrija ali pa tudi dolžina trajanja akcijskega potenciala v atrijskih celicah in sama celična struktura kardiomiocitov. Pri eksperimentih, kjer smo raziskovali vpliv eksenatida na fosforilacijo fosfolambana, smo dokazali, da 6.0 nM koncentracija eksenatida zniža fosforilacijo na Thr17 v levem ventriklu. Rezultat je bil v nasprotju z našimi pričakovanji, saj znižana fosforilacija PLB-ja poveča inhibicijo SERCA2α. Ta ATP-aza torej črpa manj kalcijevih ionov nazaj v SR, kar bi sčasoma lahko vodilo v pomanjkanje celičnih zalog kalcija in znižano srčno kontrakcijo. Razlog temu ostaja neznan. Regulacija kalcija v srcu je namreč zelo kompleksna in zahteva nadaljnje raziskave. V tkivu levega atrija statistično značilnih sprememb v fosforilaciji na mestu Thr17 nismo opazili. Razlog temu so zopet razlike med srčnimi celicami atrija in ventrikla. Eksenatid na drugih mestih fosforilacije pri PLB ni povzročil statistično značilnih razlik.Protein kinaza B oz. AKT v kardiomiocitih uravnava različne celične funkcije. Nekatere do sedaj opravljene študije ugotavljajo, da AKT uravnava prehod kalcijevih ionov skozi kalcijeve kanalčke tipa L in tako vpliva tudi na fosforilacijo fosfolambana ter aktivnost SERCA2α. Pri naših eksperimentih ob izpostavitvi srčnega tkiva 6.0 nM koncentraciji eksenatida nismo opazili statistično značilnih razlik v fosforilaciji AKT. Eksperiment, kjer smo ugotavljali spremembo fosforilacije Ser23/24 na Troponinu I, smo lahko izvedli le v levem ventriklu, saj pri levem atriju pri prenosu western ni bilo prisotnega signala. Razlog temu bi bili lahko neugodni eksperimentalni pogoji. Analizirali smo torej le proteine iz levega ventrikla, kjer pri kvantifikaciji fosforilacije troponina I nismo opazili statistično značilnih razlik. Troponinski kompleks leži v drugem delu celice kot RyR in PLB in obstaja verjetnost, da eksenatid nima vpliva na proteine, ki ležijo na drugih predelih celice, stran od GLP-1 receptorjev in SR-ja.
Zaključimo lahko, da eksenatid vpliva na fosforilacijo določenih proteinov, uravnavanih s kalcijem v srčni mišici. Vpliv 6.0 nM raztopine eksenatida je pokazal statistično značilne razlike v levem ventriklu. Fosforilacija proteina fosfolambana je bila znižana na Thr17 in fosforilacija rianodinskih receptorjev je bila povišana na Ser2808. Na ostala mesta fosforilacije na PLB in RyR in fosforilacijo protein kinaze B ter troponina I 6.0 nM raztopina eksenatida ni imela signifikantnega učinka. Za dokaz vpliva eksenatida bi lahko v prihodnje uporabili višjo koncentracijo raztopine ali kombinacijo eksenatida in GLP-1 ter poskusili najti druge PKA-odvisne transkripcijske faktorje, ki bi lahko imeli učinek na srčno kontrakcijo.
|
